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GST-pull down在蛋白质工程研究中的应用

生物咖啡茶 2019-06-08 04:14:49

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GST-pull down


     GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术,近年来越来越受到广大学者的青睐。其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和填料上(GST Focurose 4FF汇研生物www/huiyan-bio.com w/q:514099167),作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行,操作方便。

原理

      GST融合蛋白沉降技术利用了GST对谷胧甘肤偶联球珠的亲和性,从非相互作用蛋白的溶液中纯化相互作用蛋白。 GST融合的探针蛋白从细菌中表达和纯化,并平行制备细胞裂解液(可被35S标记或非标记),再将GST融合蛋白探针和细胞裂解液在谷胧甘肤琼脂糖球珠存在下混合并孵育,以使蛋白结合。GST融合探针蛋白和任何结合分子被离心收集,获得的混合物经洗涤后,用过量游离的谷胧甘肤洗脱或直接在SDS-PAGE上样缓冲液中煮沸。蛋白质经SDS-PAGE分离后进行下一步的western印迹、放射自显影及蛋白质染色分析。GST沉降技术对探测蛋白在溶液中的相互作用特别有用,而这种相互作用在膜的分析中可能是检测不到的。

应用

      GST沉降实验通常有两种应用:确定融合(或探针)蛋白与未知(或靶)蛋白间新的相互作用(Kaelin et al. 1991, Grlinick and Chao 1996),以及证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用(例子请见Posern et al. 199$, Grgureaich et al. 1999, Hunteret al. 1999, Sun et al. 1999)。这两种实验的设计和实施都有所不同。

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