高通量检测单细胞中RNA和蛋白质的新方法

2023-05-18 23:00:13

定量单细胞中的RNA和蛋白质，这有助于了解组织或肿瘤内的基因表达有何差异。多年来，为了实现精确定量，人们开发出各种各样的方法。


大约20年前，Robert Singer及其同事开发出单细胞荧光原位杂交（sm-FISH）方法。它已被证明是在细胞水平上研究RNA定位的宝贵工具。与RT-PCR不同，sm-FISH用许多短的寡核苷酸探针（大约20个碱基）来靶定单个转录本。研究人员在每条探针上连接单个荧光基团，继而在显微镜下观察微弱的荧光。


之后，为了提高这种技术的可靠性，研究人员在同一RNA上连接大约50个寡核苷酸探针。这样，每个mRNA分子都发出强烈的荧光，在显微镜下清晰可见。最近，这种技术又与免疫荧光结合，以便观察和定量每个细胞中的蛋白质和RNA。尽管这是一种强大的方法，但在显微镜下分析大量细胞，仍然是相当费时费力的。


近日，美国罗格斯大学的Sanjay Tyagi及其同事开发出一种新方法，解决了这一挑战。他们在流式细胞仪上实现了高通量的sm-FISH和免疫荧光分析，可同时定量单细胞中的mRNA和蛋白质。这项成果发表在《Nature Protocols》杂志上。


据介绍，这种称为FISH-Flow的新技术可以检测每个细胞中低至10个拷贝的mRNA分子，以及细胞表面和细胞内的各种蛋白质。它适用于悬浮培养和贴壁培养的细胞。


Tyagi表示：“尽管sm-FISH有着检测单分子的灵敏度，但必须对大量细胞进行成像，才能了解细胞群体的平均行为。将单细胞FISH转移到流式细胞仪，避免了高倍数成像带来的艰巨工作，因为现在可以一次分析数千个细胞。”


Tyagi的团队首先在HeLa细胞中利用c-fos和GAPDH探针进行了检验，并利用显微镜和流式细胞仪来观察荧光。他们还证实，干扰素-γ在CD3阳性和阴性活化的T细胞中表达，干扰素诱导的GTP酶（IRGA6）在小鼠巨噬细胞中表达。最后，他们利用RNA探针比较了细胞群体中的干扰素-γ表达。


当然，FISH-Flow也要一些限制。例如，它不适用于不足500个核苷酸的RNA，因为每个RNA至少需要30个探针。此外，许多基因的表达水平很低，每个细胞只有几个拷贝。“我们预计，通过FISH-Flow来检测这种低表达的RNA是很有挑战性的。必须发明无背景的原位信号放大技术才行，”Tyagi说。


尽管如此，FISH-Flow这种技术适用于大多数RNA以及荧光探针-抗体组合，只要包含阳性对照和阴性对照，细胞是健康的，且细胞没有固定太久。


原文标题


FISH-Flow, a protocol for the concurrent detection of mRNA and protein in single cells using fluorescence in situ hybridization and flow cytometry



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