饲料和饲料原料中粗蛋白含量测定的影响因素分析

饲料和饲料原料中粗蛋白含量测定的影响因素分析

为了准确、快速的得到测试结果，必须严格遵守标准中的每一个步骤。每个环节都有一些需要注意并且容易出现错误的地方，下面我们对GBT 6432-1994《饲料中粗蛋白测定方法》进行归纳总结。

一、样品制样

制样原理：使试样从不规则的固体颗粒状成为较小的均匀统一的粉末，有利于反应的充分进行，增加结果的准确性。

     1、粉碎

   ☞事例1：以豆粕为例：豆粕因为其生物结构特性：表皮较脆软易粉碎，但蛋白含量低；豆粕芯质地较硬难粉碎，蛋白含量高。故实际操作中会出现粉碎不均匀的现象。

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图一

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图一是本实验用于粉碎样品的刀片型粉碎机，对豆粕表皮具有很好的粉碎性，对豆粕芯会出现不易完全粉碎的情况。

图二

图二所示：上图是未过筛的试样；左下图试样40目筛上物；右下图试样40目筛下物。我们可以清晰的看出：上图粉碎之后的豆粕试样仍然很不均匀，粗细不一；左下图筛上物量多，大多为豆粕芯未通过筛；右下图过筛后的豆粕均匀细腻。
 

在实际情况中用粉碎机粉碎后，我们选择不过筛，而是把试样装入样品袋中，摇匀，平放，用小号粮食取样器以对角线直插入样品袋取出样品，尽可能保证取样的均匀性。因为我们之前对过筛和不过筛的样品进行实验（见表1），结果显示过筛的试样蛋白含量是偏小的，因为通过筛的大多是蛋白含量较低的豆粕表皮，留在筛上的是蛋白含量较高的豆粕芯，因而影响结果。

表1 粉碎程度对粗蛋白含量测定结果的影响（%）

样品	粗蛋白实际含量	不过筛均匀取样含量	完全粉碎后过筛均匀取样含量
豆粕	45.06	45.04	44.36

因饲料对粗蛋白含量的精确度要求较高，从上表结果中我们可以看出，粉碎程度对蛋白含量测定结果的影响之大。

     ☞事例2：以鱼粉为例：先将粉状试样充分摇匀，再用四分法分样至200g。进粉碎机充分粉碎，装入试样袋。下图中左图为未粉碎的鱼粉试样；右图为粉碎后的鱼粉试样。可看出粉碎后的鱼粉颗粒均匀规整

图三

一般试样：原则上是采用四分法采样，四分法采样是针对量多的样品。但是实际检测中，我们接到委托单的样品约在200g，所以采取全粉碎不过筛均匀取样的方式

       2、样品称量

用分析天平准确称取0.2-0.5g（精确到0.0001g），以保证式样的含氮量在30-40mg。使滴定时盐酸滴定液的消耗体积保持在10-20ml之间，会较大程度上避免滴定液体积过小带来的误差，提高结果准确性。根据实验总结：浓缩饲料（粗蛋白含量≥40%），称量范围可在0.2-0.3g之间；配合饲料（粗蛋白含量≤20%），称量范围可在0.4-0.5g之间。

二、消化

消化原理：试样同催化剂（硫酸铜+无水硫酸钠）（催化剂的作用：加速、完全有机物质的分解，缩短消化时间，）和浓硫酸反应，使蛋白质遭到破坏，使试样中的蛋白质氮及其他有机氮转化为氨态氮，然后与硫酸结合生产成硫酸铵。便于氮含量的测定。

试样+ H₂SO₄SO₂+H₂O+CO₂

2NH₃ + H₂SO₄﹦(NH₄)₂SO₄

  1、消化装置

消化器（图四）因其孔槽受热程度存在差异，所以会和预设温度存在偏差，影响消化结果。故定期对消化装置进行维护和检查，确保装置的加热均匀。

图四

☞事例3：对消化器不同孔的温度进行考察，结果如表2

表2 消化器各孔间的温度对比（℃）

孔	1	2	3	4	5
温度	420	405	419	419	419
蛋白含量（%）	42.13	40.05	42.07	42.04	42.09

可以看出，不同的消化孔存在明显温度差异，如孔2：测试蛋白含量偏差严重，消化温度偏低，使消化不完全影响含量测定的结果。分析孔2温度差异的原因：消化器长期使用，使得空内有污垢、结块，影响传热所致。故须定期维护。

2、消化时间及温度

根据标准规定：消化时间要达到4h，时间不充分会造成消化不完全，消化时间过长会造成蛋白的损失已及浪费能源。

要使消化温度达到420℃，使消化完全，温度低会造成消化不完全，温度过高会使氮气逸出影响结果。

表3 不同消化时间对鱼粉、豆粕、DDGS的检测结果的影响

消化时间/h	鱼粉（%）		豆粕（%）		DDGS（%）
	350℃	420℃	350℃	420℃	350℃	420℃
2	40.18	53.32	30.82	40.47	15.46	20.14
3	57.88	60.02	38.66	41.58	22.18	24.50
4	62.86	64.24	41.44	43.12	24.30	27.39
标准值	64.25		43.14		27.33

从表3可知，最佳消化时间为4h，最佳消化温度为420℃。消化的时间和温度都对检测结果的影响很大。进行实验时要严格把控。


       3、催化剂

添加催化剂是为了提高硫酸沸点、加快有机物分解。但是催化剂添加量也需谨慎：用量过少使有机物分解速度缓慢，延长消化时间；催化剂用量过多，易造成氮的损失。国标规定：6.4g催化剂对12ml硫酸可满足大部分样品需要。如若增加酸的量，可适当对催化剂的量进行调整，以及蒸馏时碱的用量也需调整。

       4、硫酸含量

方法中使用硫酸来破坏蛋白质，所以硫酸的质量严重影响后续实验的结果。需要格外注意的是不能使用含氮的硫酸，对硫酸成分要事先验收。

☞事例4：本实验室有一次换用其他品牌的硫酸，验收时发现其中含有氮，所以不能用于蛋白的检测。将其与不含氮的硫酸同条件进行实验，看其对结果的影响多大。含氮硫酸测出的蛋白含量为45%，与客户提供的参考值40%相差5%；使用验收不含氮的硫酸测量后的结果为40.06%，与顾客提供值无差。由此可见，硫酸质量对结果的影响，实验前务必做好验收工作

图五为消化完全后的试样，呈澄清的蓝绿色。

图五

三、蒸馏

蒸馏原理：在硫酸铵中加入过量强碱（氢氧化钠溶液）进行蒸馏，加热，使NH₄⁺转变成NH₃逸出，同时用硼酸吸收，硼酸接受氨后，形成四硼酸铵。

2NH₄⁺ + OH^-﹦NH₃ + H₂O 
NH₃ +H₃BO₃﹦NH₄⁺ + H₂BO₃^-

每次蒸馏前都要先对凯氏定氮仪进行检查、清洗，方可使用。

      1、蒸馏检验：仪器含氮量测定能力

精确称取0.2g硫酸铵代替试样，对其进行蒸馏、滴定、计算。得到的含氮量应为21.19±0.2%。若结果低于该值，可能是由于（1）蒸馏不完全；（2）定氮仪漏气；（3）加入的碱未过量等情况造成，会导致检测结果偏低。若结果高于该值，则可能是（1）凯氏定氮仪受到了污染；（2）消化、滴定等步骤出现错误，检测结果会偏高。以上两种情况都不能继续实验，要查明原因。

       2、蒸馏时间

把握好蒸馏时间，适宜的时间是5min。低于5min，结果蛋白质含量偏低；高于5min对结果没有明显改善，还会造成时间和资源的浪费。

表4 蒸馏时间对粗蛋白含量测定结果的影响（%）

蒸馏时间/min	3	4	5	6	7
粗蛋白含量	44.85	45.08	45.10	45.10	45.12

严格把控蒸馏时间，保证结果准确性。

       3、加入碱的浓度

选用40%的NaOH水溶液 50ml，分5次加入，使其充分与试样溶液反应，从蓝绿色变成黑色。只有与NaOH溶液充分反应，才能使氨气充分逸出。

图六

图六左图为蒸馏中的凯氏定氮仪；右图为蒸馏后准备滴定的试样。

四、滴定

滴定原理：用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH₃的摩尔数，通过计算即可得出总氮量。在滴定过程中，滴定终点采用甲基红-溴甲酚绿混合指示剂颜色变化来判断。测定出的含氮量是样品的总氮量，包括有机氮和无机氮。

H₂BO₃^- + H⁺﹦ H₃BO₃

       1、滴定时的温度

滴定温度是易忽视的因素，室内是否处于恒温状态，会造成滴定液的体积变化（易热胀冷缩），温度骤升，使盐酸滴定液膨胀，导致结果偏大；反之，温度骤降，结果偏小。所以在实验开始前要确保实验室的温度状况，保证25℃恒温。否则严重影响计算结果。

       2、指示剂

是否使用有效的指示剂：甲基红-溴甲酚绿混合指示剂应保存在阴凉处，保质期是2个月，指示剂的加入量为1-2滴。

图七

            3、滴定液的影响

盐酸滴定液直接影响计算结果，要确保盐酸标准溶液是否准确（标准中为0.02M或0.1M）。我们严格按照GB/T 601-2002 化学试剂 标准滴定溶液的指标中的相应规定，采取两人四平行对滴定液进行标定。

表5 不同样品、不同浓度盐酸滴定的平均消耗量（ml）

样品	盐酸平均消耗量（M）
	0.10	0.05
进口鱼粉	6.75	13.65
豆粕	4.85	9.75
玉米秸秆饲料	0.85	1.55

不同浓度的盐酸对同一个样品的影响巨大，较好的盐酸滴定液消耗量在10-20ml之间。

       4、酸式滴定管

定期对滴定管进行校准，控制偏差。

        5、空白样、质控样

是否有空白样和质控样，才能保证结果的准确度和可信度。空白样品消耗盐酸的量以0.05-0.15ml为宜，检测时如果发现空白值过高，应及时解决。一般是由试剂级别不够，实验用水不纯或玻璃器皿不净等所致。质控样是已做出并得到肯定的结果，质控样能够对整个实验过程起到监控作用。

       6、终点判断

对于终点的判断（图八左上），要与空白样（图八左下）的颜色保持一致，这样才能保证实验的一致性、准确性。可以在滴定架的下方和垂直面均放置白色比色板方便观察。读数时一定要水平直视刻度线（图八右上），不能偏高或偏低误读。

图七

◀图八

以上，是凯氏定氮法检测饲料中粗蛋白过程中需要注意的问题和对应的解决方案，做到以上这些，能提高实验的准确度，减小误差。

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本文作者 ：技术部 吉杨萱