仔猪从出生开始，肠道内就从无菌状态被各种细菌寄生，并逐渐形成有规律的肠道菌群。肠道内正常菌群对仔猪消化吸收、生长发育及营养转化都具有十分重要的意义。产蛋白酶菌株是一种广泛存于在自然界中的能够产生胞外蛋白酶的细菌。由于其分解蛋白质能力较强，被应用在工业、畜牧业等各个行业。
目前，豆粕是在猪生产中一种最常见的蛋白质饲料，因其蛋白质和必须氨基酸含量丰富，在世界范围内广泛使用。但随着畜牧业的迅速发展，我国的大豆产量早已远远不能满足需要。为了解决常规蛋白质饲料资源不足问题，棉籽粕作为我国资源丰富且优质的蛋白源被广泛研究。研究表明，棉籽粕蛋白质含量较高，尤其精氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸含量较豆粕更高。因蛋白源理化因素差异，仔猪肠道中产蛋白酶菌株对其利用必然具有较大差异。本试验拟从仔猪小肠中筛选出一株产蛋白酶菌株，研究其对不同蛋白源的降解作用，为筛选仔猪适宜的日粮蛋白源提供依据。
1.1 试验材料
样品
健康仔猪小肠肠道内容物；豆粕、棉籽粕、鱼粉，蛋白含量分别为44%、40%、65%，市售。
培养基
LB培养基：蛋白胨 1%、酵母提取物 0.5%、NaCl 0.5%、琼脂 2%，pH值7.2，121℃灭菌20 min。
NA培养基：蛋白胨 1%、牛肉浸膏 0.3%、NaCl 0.5%、琼脂 2%，pH值7.2，121℃灭菌20 min。
酪蛋白平板培养基：酪蛋白 1%、牛肉浸膏 0.3%、NaCl 0.5%、KH2PO4 0.2%、琼脂 1.5%，121℃灭菌20 min。
种子培养基：葡萄糖 1%、蛋白胨 0.5%、牛肉浸膏 0.5% 、NaCl 0.5% 、KH2PO4 0.1% 、MgSO4·7H2O 0.02%、CaCl2 0.02%，pH值7.0，121℃灭菌20 min。
豆粕发酵培养基：豆粕粉 2%、玉米淀粉 2%、Na2HPO4·12H2O 0.4%、KH2PO4 0.03%，pH值7.0。
棉籽粕发酵培养基：棉籽粕粉 2%、玉米淀粉 2%、Na2HPO4·12H2O 0.4%、KH2PO40.03%，pH值7.0。
混合发酵培养基：棉籽粕粉 1%、豆粕粉 1%、玉米淀粉 2%、Na2HPO4·12H2O 0.4%、KH2PO4 0.03%，pH值7.0。
鱼粉发酵培养基：鱼粉 2%、玉米淀粉 2%、Na2HPO4·12H2O 0.4%、KH2PO4 0.03%，pH值7.0。
1.2 试验方法
菌株的分离与纯化
从刚宰杀的健康仔猪小肠中采集一段小肠肠段，在厌氧环境中，用10 mL灭菌PBS冲洗肠道，经4层纱布将肠道内容物过滤至灭菌的取样瓶中，盖紧瓶口，即为菌液，备用。吸取100 µL菌液分别涂布在LB琼脂平板和NA琼脂平板上，于37℃厌氧培养箱中培养24 h。根据两种培养基上菌株形态不同，挑取菌落接种至LB、NA斜面培养基上，于37℃厌氧培养箱中培养24 h。
产蛋白酶菌种的筛选
初筛： 将分离得到的菌种挑取单菌落点种于酪蛋白平板上，于37℃厌氧培养箱中培养48 h。观察菌落周围是否有水解圈产生，测定水解圈与菌落直径比值（D/d），挑取比值较大的菌株进行复筛。
复筛： 挑取得到的菌种单菌落接种至种子培养基中，37℃，180 r/min振荡培养24 h制成种子液。以2 %接种量接种到装有50 mL豆粕及棉籽粕发酵培养基的250 mL锥形瓶中，37℃，180 r/min振荡培养48 h。取发酵液，4℃，10 000 r/min离心10 min。用福林酚法测定上清液中的蛋白酶活性参照《GB/T 23527-2009蛋白酶制剂》，筛选出蛋白酶活性较强的菌株。
菌种鉴定
形态学及生理生化鉴定： 将得到的菌株分别进行分离划线，于37℃培养24 h，观察菌落颜色、大小、表面形态、边缘形状、和隆起形态等菌落特征。将菌株制片并革兰氏染色，在光学显微镜下观察菌体颜色、形态等。使用细菌生化鉴定管进行生理生化检验，细菌生化鉴定管购自杭州微生物试剂有限公司。
分子生物学鉴定： 使用细菌基因组提取试剂盒提取菌株总DNA。以总DNA为模板，利用16SrRNA通用引物进行PCR扩增，测序。引物序列：27f：5´-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3´；下游引物：1492r：5´-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3´；反应体系25 µL：DNA模板1 µL，正向引物1.5 µL，反向引物1.5 µL，2×Taq PCR Mix 10 µL，ddH2O 11 µL；反应程序：94℃ 5 min变性；94℃ 30 s变性，57.9℃ 30 s退火，72℃ 30 s 延伸，30个循环；72℃ 10 min延伸。0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取及PCR扩增情况。利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对PCR产物进行切胶回收。细菌基因组提取试剂盒及琼脂糖凝胶回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，引物合成及PCR扩增产物测序由上海生工生物工程股份有限公司完成。测序结果经Blast比对，利用ClustalX 2和MEGA 6.0构建系统发育树。
不同蛋白源下菌株产蛋白酶活力曲线
按2 %接种量将菌株分别接种于豆粕、棉籽粕、混合和鱼粉发酵培养基中，37℃，180 r/min振荡培养。分别在4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72 h取上清液测定蛋白酶活性，方法同复筛中蛋白酶活性检测方法。由此绘制产酶曲线，以确定不同蛋白源对菌株产蛋白酶活性的影响。
不同蛋白源下菌株蛋白消化率变化
按2 %接种量将菌株分别接种于豆粕、棉籽粕、混合和鱼粉发酵培养基中，37℃，180 r/min振荡培养。分别于0、6、12、24、48、60、72 h取样，4℃，10 000 r/min离心10 min，分离上清和沉淀备用。上清中加入等体积10 %TCA，充分混合后4℃，5 000 r/min离心15 min，弃去上清；向第1次离心沉淀中加入20 mL灭菌PBS，充分振荡，4℃，2000 r/min离心10 min，收集沉淀。上清继续以上述方法离心两次，收集沉淀。收集几次差速离心后沉淀即为弃去菌体后发酵底物。用凯氏定氮法检测发酵底物中蛋白质含量，参照《GB/T 50095-2010食品中蛋白质测定》。用以下公式计算不同时间蛋白消化率并绘制曲线。
2.1 菌株的筛选
从LB培养基和NA培养基中分离得到菌群形态各异肠道菌株共78株。将78株菌分别接种到酪蛋白平板后，得到5株水解圈菌落比值（D/d）较大的菌株，依次编号为1L5、2L4、2L6、3L4及5N7。接种到锥形瓶进行复筛，结果表明菌株2L6在豆粕及棉籽粕发酵培养基中酶活都较高且稳定（P＞0.05），因而选取菌株2L6进一步研究。初筛及复筛结果见表 1、图 1和图 2。
2.2 菌株的鉴定
形态学及生理生化鉴定
在LB平板上菌株2L6呈白色，大小中等，表面形态不规则且隆起，边缘形状呈锯齿状。革兰氏染色后镜下菌体呈杆状，两端钝圆，革兰氏阳性。生理生化试验结果显示菌株生理生化特性与芽孢杆菌相似。故将菌株2L6初步鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus）。
分子生物学鉴定
对菌株2L6 16SrRNA基因序列进行Blast比对，并对其同源序列利用ClustalX 2和MEGA 6.0软件进行NJ法构建系统进化树，结果如图 3所示。该菌株序列已递交GenBank 数据库，登录号为KP700957。Blast比对显示，菌株2L6与Bacillus cereus strain CCM 2010、Bacillus cereus strain ATCC、Bacillus thuringiensis Bt407、Bacillus toyonensis strain BCT-7112、Bacillus weihenstephanensis KBAB4、Bacillus weihenstephanensis strain DSM有97%同源性。从而鉴定，2L6为蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus strain 2L6）。
2.3 不同蛋白源对菌株蛋白酶活性影响
如图 4所示，在豆粕培养基中2L6蛋白酶活性在第12 小时达到最大值为16.61 U/mL，在第40 小时酶活开始显著下降（P＜0.01）；在棉籽粕培养基中，蛋白酶活性在第68 h才达到最大值为13.73 U/mL；在混合培养基中，20 h时蛋白酶活性达到4种蛋白源中酶活最大值
为21.31 U/mL，在第52小时 开始出现下降（P＜0.05）；而鱼粉发酵培养基中，蛋白酶活性一直呈现较低水平，没有明显上升和下降时期，最大值出现在32 h和52 h，分别为2.69 U/mL和2.61 U/mL。
2.4 不同蛋白源对菌株蛋白消化率影响
在豆粕、棉籽粕和混合培养基中，菌株2L6蛋白消化率均在第0～36 小时呈显著上升（P＜0.05），在36～72 h上升不显著（P＞0.05）；而鱼粉培养基中，在60 h之前蛋白消化率一直呈显著上升（P＜0.01）。在第6 小时和第 36小时 混合发酵培养基中蛋白消化率均高于其他组（P＜0.05），而在72 h 4组均达到最大值后，豆粕组蛋白消化率大于其他组。
3.1 仔猪小肠主要产蛋白酶菌筛选
为剔除仔猪肠道中消化液对日粮降解作用，研究不同蛋白源在小肠阶段被产蛋白酶菌降解程度，本试验通过细菌分离培养、蛋白水解圈法从仔猪小肠中分离一株在豆粕和棉籽粕发酵培养基中蛋白酶活性都较大的菌株2L6。 Suganthi等从印度杜蒂戈林地区盐田地带中筛选出一株地衣芽孢杆菌（TD4），酶活达到89.87 U/mL。而肠道中分离出产蛋白酶菌酶活性较低。本试验筛选得到的蜡样芽胞杆菌2L6在豆粕-棉籽粕培养基中20 h达到蛋白酶酶活最大值21.31 U/mL。许禔森等从鲈鱼肠道中筛选出18 株产蛋白酶菌，最高的4 株菌蛋白酶活性均在5 U/mL以下。李慧等从猪粪中筛选出产蛋白酶菌酶活性也较低。可能是肠道中胃肠蛋白酶对细菌产蛋白酶能力有一定影响。
分子生物学方法是菌种鉴定中较为准确且快捷的方法。为避免基因测序中不稳定因素，本试验结合形态学、生理生化鉴定及16SrRNA分子生物学方法鉴定该菌为蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus strain 2L6）。
3.2 对不同蛋白源的利用
在进行不同蛋白源筛选的过程中，蛋白酶活性是反映菌株对底物蛋白质利用的一个重要指标。不同蛋白源对菌株刺激程度不同，蛋白酶活性也不同。王再贵等优化家蚕肠道产蛋白酶菌株发酵条件时，便发现利用不同蛋白源作为氮源时，蛋白酶活性不同，其中黄豆粉作为氮源时菌株蛋白酶活性最高。本试验结果表明，菌株2L6蛋白酶酶活性在豆粕培养基中达到最大值时间最短，而棉籽粕培养基中达到最大值时间最长，但两者最大酶活性相似。在混合培养基中，菌株2L6酶活在较短时间即达到了比前两者更高的酶活，说明混合培养基更适合菌株2L6产蛋白酶。
微生物蛋白消化率是反映菌株利用底物蛋白质的另一个重要指标。菌株通过胞外蛋白酶分解底物蛋白质后，对游离氨基酸和肽段加以利用。但由于不同蛋白源在氨基酸组成、蛋白质结构和其他理化因素方面具有较大差异，造成菌株在蛋白利用率方面不同。本试验结果显示菌株2L6对不同蛋白源底物蛋白质消化率有明显差异。其中豆粕-棉籽粕混合培养基在最短时间降解程度即达到最高。可能是因为在两种蛋白源组合的情况下，氨基酸组成更加平衡达到了互补，分解速度更佳，菌株利用效果更佳。因此，豆粕-棉籽粕组合更容易被小肠中产蛋白酶菌株2L6利用。
注：本文原文刊登在《中国畜牧杂志》2016年9期，作者为曹克飞，孙 会， 张海环，白晓鹭，郭昊鹭。如需阅读本期纸刊更多精彩，可与《中国畜牧杂志》编辑部联系。如需转载，请注明出处。