打开生物标志物筛选鉴定的正确方式

黑色素瘤是皮肤最致命的肿瘤，在全球范围内发病率和死亡率都在上升。黑素瘤的发展经过不连续的阶段，具有众所周知的临床和组织学特征，然而，关键的潜在分子尚未被明确阐明。故鉴定预后和预测意义的生物标记将有助于更好地了解相关的生物通路。而黑色素瘤后期的黑素含量和储存的甲醛固定石蜡标本(FFPE)使得基因表达分析比较困难。

加州太平洋医疗中心的John C. Moretto等人的策略是使用两种基因表达分析技术来验证芯片数据，在把黑色素瘤和正常皮肤样本分好类后，一是用QuantiGene® Plex Assay直接对组织裂解物进行基因表达定量，二是继而通过ViewRNA® ISH Tissue Assay对FFPE组织切片进行原位杂交分析。

而需要说明的是，这两种分析方法，都是基于branched-DNA技术，能够直接、特异性、定量检测mRNA，无需RNA分离纯化，反转录和PCR扩增。

Step 1: QuantiGene Plex on 62 genes. Chose the genes with the highest p value.

Step 2: Learned more about the genes with the highest p value.

Step 3: Run QuantiGene View on a subset of the genes.

黑色素瘤相关的62个基因被鉴定分类，利用 QuantiGene® Plex多重基因定量，发现7个基因有显著性差异，继而进行主要成分分析和聚类分析，发现这些基因跟黑素瘤显著相关，再利用ViewRNA® ISH Tissue Assay对这7个基因进一步原位验证后，发现其中有4个基因在转移性黑色素瘤中呈显著上调。这7个候选基因在表达强度和空间分辨率上都呈现很大的不同。这些分子的功能支持血管生成，免疫应答/炎症反应，DNA复制，细胞增殖/能动性，组织侵袭/进程，以及包括表皮发育，细胞通讯和形态发生。

简单总结一下就是，FFPE样本，通过芯片筛选出62个基因，首先使用QuantiGene Plex 2.0 Assay鉴定出7个影响显著的基因。其次使用ViewRNA® ISH Tissue Assay进行进一步的原位表达强度和空间分辨率的验证。

从这篇文章中可以看出，QuantiGene Plex 2.0 快速、简单，准确度、精密度高，通量高, 同时定量检测几十个基因。无需RNA提取纯化和PCR扩增。而ViewRNA原位杂交分析特异性、灵敏度高，重复性高。

结果显示出，使用branch DNA 技术验证黑素瘤生物标记物，在基因表达定量和RNA原位杂交检测上都是非常强有力的手段！

发现生物标志物的首要一步是筛选候选分子，如基于转录组芯片或测序可以筛选到重要生理、病理过程关联的候选基因，其随后的验证及扩大的样本量的继续验证是此类研究的必要部分，主要为了通过扎实的证据进一步缩小下游研究的基因数量，进一步减小盲目性。传统的验证技术在RNA水平上主要是qPCR。说到Real-time PCR，并不是不好，但是经常会遇到一些问题：首先，要进行核酸提取，核酸抽提过程中不可避免的核酸降解，或者污染，且每个人抽提效果都不一样，这些因素都会影响你的实验结果；其次，RT 和PCR 不可避免带来假阳性。

而采用branched DNA技术，便可克服传统的real time PCR技术中的缺陷与不确定因素，它无需抽提纯化RNA，无需反转录，无需PCR扩增，只需用特定裂解液处理样本，经探针杂交和信号放大即可快速得到精确的定量结果。有些用定量PCR很难分析的血液样本，或保存多年、mRNA高度降解的FFPE样本，bDNA同样具有极高的检测准确度与重现性。

branched DNA 技术(分支链 DNA 信号放大技术，简称bDNA) 经过美国FDA认证用于病毒的检测，通过信号放大技术（而非模板放大），bDNA分析实现了对RNA转录本的直接测定！

第三个也是最关键的一个是，这两个技术, branch DNA跟qPCR最主要的一个区别是什么呢？是branch DNA带来的数据的质量！当你的CV较好的时候，你可以在更少的样本中达到更高的重现性。

基于Branch DNA信号放大技术的多重基因定量QuantiGene®Plex（简称QGP），能单孔同时定量多达80种RNA，节省大量时间，两天内就可以完成近200份样本中80 种基因的定量！大大提高了检测通量与效率！

1．对任何样本都不需要做核酸抽提：消除了抽提过程中干扰的因素。避免核酸降解，样本损失。且减少工作量。

2．不需要做反转录和PCR，避免一些假阳性。

3．数据质量高：线性相关的信号结果使数据质量更精确，且数据处理更加简单

4．特异性高：每个基因设计多个探针，高度的探针覆盖率增强了检测的特异性

5．通量高，灵活性：一个孔可以做多达80重基因，真正意义上的高通量

6．操作简单：类似核酸的ELISA，重复性更高。

7．实验快速：一天半时间可获得7680（96*80）数据点。

8．可分析任何样品，任何靶标，轻松搞定RNA抽提困难户（如血液、保存已久的FFPE等）

前期筛选的靶标要想成为真正的生物标志物应用于临床诊断等，必须经过原位的验证。RNA 原位杂交除了是对传统蛋白水平上的IHC和DNA 水平上的DNA FISH的补充，又有其独特的优势：比如不像病毒、特殊物种的IHC受抗体的限制，且时下热门的lncRNA、miRNA、cirRNA由于不表达蛋白，故RNA水平的检测无疑是绝佳的选择。

传统的原位杂交技术局限于灵敏度、特异性不高，而大部分RNA拷贝数在细胞中都很少，而且像一些癌症病人来源的组织穿刺样本,样本本身量就特别少，所以高灵敏度的原位杂交技术就显得尤其重要。So，基于b-DNA信号放大技术的单细胞单拷贝级别灵敏度的ViewRNA原位杂交技术无疑开启了细胞内定位RNA分子的新时代！其特异性的双Z探针设计避免了传统长链RNA探针的弊端，配以自身级联放大检测原理，可以高效敏感地检测到目标RNA。

1.应用广泛：针对任意RNA靶标的简单杂交分析，无放射性，无需抗体；

2.高特异性：基于专利的探针组设计和branched DNA (bDNA)信号放大技术；

3.极高灵敏度：单细胞水平实现单拷贝级别灵敏度；

4.兼容降解的RNA样本；

5.无需RNase-free操作和环境要求，一天即可完成实验；

6.多重靶标共标定位；

7.实现RNA与蛋白共定位；

8.检测结果稳定一致性，兼容高通量自动化平台。

生物标志物筛选鉴定，Branch DNA技术，你get到了吗？

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