免疫共沉淀(Co-IP)实验知多少

Co-IP主要用于检测蛋白质与蛋白质之间相互作用，是IP实验的一种扩展， 基于IP反应的潜力，在样品溶液中捕获和纯化主要目标（抗原等）及通过天然相互作用与靶标结合的其他的大分子。如将蛋白质A和抗体加入到含有蛋白质B的细胞解液中去，利用抗体提纯，若蛋白质A，B之间有相互作用，则最后提纯产物是抗体—蛋白质A—蛋白质B复合物。此外，还可以利用Co-IPs来确定在不同条件下的蛋白质相互作用。

Co-IP与传统的IP协议非常相似，其不同之处在于，需要更温和的分析条件。一般步骤如下:

1. 裂解细胞

目的是打开细胞，使蛋白质可以与抗体结合，裂解的方法非常重要。非去垢剂、低盐裂解缓冲液是裂解可溶性蛋白的一种常见方法，这种裂解最少地干扰任何蛋白质的相互作用。对于一些难溶的蛋白复合物，裂解缓冲液可能需要包含非离子去垢剂，如NP-40或Triton X-100。测试一些裂解条件，以找到最佳的裂解液，有时可根据经验来确定。

2. 添加抗体

添加针对目的蛋白的特异性抗体。许多抗体制造商会在产品选择指南中提供有用的信息。最理想的是选择一种能识别兴趣蛋白质某个表位的抗体，且这个表位不会被任何其他蛋白质相互作用所掩盖。

3. 加Protein A/G珠子

Protein A/G 珠用来从混合物中提取和纯化抗体/蛋白质复合物。Protein A和Protein G是识别和结合抗体的特殊细菌蛋白，抗体的特异性将决定应该使用哪种类型的珠子，可以咨询抗体制造商。

传统上，免疫沉淀珠是直径为50-150uM的琼脂糖球，通过离心分离纯化抗体/蛋白复合物。现代技术使用直径1-4微米的磁珠代替琼脂珠，磁珠通过磁力作用将抗体/蛋白复合物分离。

磁珠对分子量较大的蛋白质复合物和处理少量样品有更好的效果，避免在离心过程中出现过多的样品损失。琼脂糖珠通常具有较高的产量，因为它们表面积较大，可以结合更多的蛋白。

4. 孵育

孵育期间，珠子/抗体/蛋白发生相互作用，孵育时间由一小时到过夜不等，取决于选择的珠子。通常，孵育时温和地搅动，如在低速的摇臂板上，可以增加互作的机会。

5. 收集

孵育后，需要收集抗体/蛋白复合物，通过磁性或离心法将复合物与其他细胞蛋白质分离。

6. 洗珠子

清洗抗体/珠子复合体几次，以去除与抗体非特异性结合的细胞物质，也有助于减少粘性细胞成分与珠子的非特异性结合。一般情况下，用冷的裂解缓冲液或PBS洗涤。此步需要优化，以找到合适的水平，不破坏蛋白质的相互作用。保存此步中使用过的清洗buffer，如果目的蛋白和伴侣蛋白从裂解液中耗尽，清洗缓冲液可以说明。

7. 洗脱蛋白

如果使用SDS-PAGE，可以直接添加上样缓冲液到珠子中来获取蛋白质。如果想要分离的蛋白质用于酶实验等，则用其他方法洗脱。一种常用的非变性洗脱液是0.1M甘氨酸，pH值较低(约2.5-3)。然而，在这些条件下，一些蛋白质仍然会发生变性或疏松的酶活性。

8. 检测蛋白

可以进行SDS-PAGE，质谱，酶实验，等等。

用来纯化蛋白质的抗体也在洗脱液中，这可能是个问题。western blot可以检测洗脱液中的抗体，如果它们分子量接近，就掩盖了对目的蛋白质的检测。克服此问题，也许可以通过使用与抗体共价结合的珠子，或者WB使用的二抗和IP二抗识别不同的种属。

9. 使用表面等离子体共振(SPR)研究相互作用。

发现目的蛋白相互作用的值得兴奋的，但是许多科学家被粘蛋白引入歧途。应该做额外的研究来确认任何潜在的相互作用，确保它们是特异性的。例如，可以使用突变分析来映射结合位点，或者，可以考虑使用SPR应用。

SPR应用不仅证实了相互作用，还提供了对亲和力、热力学的定量测量，实时动力学。SPR生物传感器，允许测量在不同温度下的相互作用，便于对感兴趣的相互作用进行热力学分析。SPR的一个主要优点是，不需要标记你的兴趣蛋白，没有更多的标记克隆或放射性，节省时间和克隆时的潜在麻烦。如果想要检测和阐明免疫受体和它们的配体之间的相互作用，可以考虑尝试一种生物传感器检测，允许测量配体对其特定抗原受体的结合率和解离率。由于SPR的优势和巨大的性能，SPR及其相关应用已经成为动力学和亲和力测定的黄金标准，SPR原则强调了大多数基于颜色的生物传感器芯片的应用。