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医学实验常用方法学简介

菜鸟联盟成长记 2019-06-11 15:36:37

研究技术

(一)光学显微镜技术

(二)电子显微镜技术

(三)组织化学术

(四)免疫组织化学术

(五)原位杂交术

(六)细胞和细胞化学定量术

(七)组织培养术

(八)放射自显影术

    问  题                                  解决方法

观察对象太小                         显微镜

光线不能透过观察对象           切片

观察对象缺乏反差                   染色

观察对象生化成分不同           细胞化学、免疫组织化学

观察对象为生活状态               培养

(一)光学显微镜技术

1、一般光学显微镜

2、荧光显微镜

3、相差显微镜

4、激光扫描共聚焦显微镜

(二)电子显微镜技术

1、透射电子显微镜

2、扫描电子显微镜

(三)组织化学术

1、多糖

2、脂类

3、酶

4、核酸

(四)免疫组织化学术

(五)原位杂交术

(六)细胞和细胞化学定量术

1、显微分光光度测量术

2、形态计量术

3、流式细胞术

(七)组织培养术

(八)放射自显影术

(一)光学显微镜术light microscope(LM)

1 石蜡切片

①取材  Formalin 40%,  4%

②固定  Bouin 、Formalin 40%,25ml; 苦味酸饱和水溶液   75ml; 冰醋酸 5ml                                                

③脱水--乙醇、包埋--石蜡

④切片 6um

⑤脱蜡   二甲苯→乙醇 →水 

⑥染色 HE Hematoxylin: 核酸RER、 Ribosome

                    Eosin: 蛋白、膜结构(mitochondria、 SER、lysosome)

⑦透明、封片

2、冰冻切片

      组织置入液氮(-196℃)快速冻结,恒冷切  

      片机切片、染色。

      更好保存细胞内酶的活性、蛋白质结构。

      缺点:组织片厚,经冷冻后易破坏组织结构

3、涂片 血涂片 精液 痰液 培养细胞

4、铺片

5、磨片 骨和牙需制成磨片、经染色后观察

(二)电子显微镜技术

    电子显微镜(简称电镜)的发明和使用,使组织胚胎学研究内容发生了深刻变化。光镜分辨率为0.2um,放大倍数约为1000倍,而电镜的分辨率为0.2nm,比光镜高1000倍,可放大几万倍至几十万倍,因此电镜能观察到更微细的结构。在电镜下所见的结构称为超微结构(ultrastructure)。

1、透射电镜(transmission electron microscope)

        用于观察细胞内部结构,标本制备比光镜的要求更严格,组织块要更新鲜,体积更小(1mm3),固定常用戊二醛和锇酸。切片则用超薄切片机,制成50~80nm的超薄切片,用醋酸铀和柠檬酸铅染色,然后在电镜下观察并摄片。

2、扫描电镜(scanning electron microscope)

        用于观察组织或细胞表面的微细结构,标本需经喷镀金属膜特殊处理,然后在扫描电镜下观察,在荧光屏上扫描成像,呈现富于立体感的表面图像,如细胞表面的微绒毛、纤毛和细胞伸出的伪足等。


2、荧光显微镜(fluorescence microscope)

     由光源、滤光系统和显微镜三个部分组成。光源为高压汞灯,可产生紫外光,标本中的自发荧光物质或经荧光素染色或标记的结构在紫外光激发下可产生各种颜色的荧光,以此来研究该荧光物质在细胞和组织中的分布。

3、相差显微镜(phase contrast microscope)

        用于进行细胞培养中活细胞的观察,可使无色透明的细胞镜下结构反差明显,图像清晰。

4、激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal          microscope)

        是近年研制和应用的一种新型显微镜。它将激光束落在样品上,并作移动扫描,对样品内某种荧光标记的物质进行二维和三维的动态微量分析测定。可用来研究活细胞内Ca2、 Na+和 K+等pH值的动态变化;细胞内各种细胞器、细胞骨架、核酸、蛋白质和受体等的定位和定量分析;细胞膜电位、膜通道及信息传递的检测;利用激光对细胞结构或染色体作切割、分离和克隆等逐渐成为生物医学研究中重要的研究手段。

(三)组织化学术(histochemistry)

        应用化学反应与物理反应原理检测组织或细胞内某种化学成分并进行定位、定量及相关功能研究的技术。

1、多糖  

        显示多糖或蛋白多糖的常用方法是过碘酸—雪夫反应(periodic acid Schiff reaction,PAS反应)。组织或细胞中的多糖被结合形成紫红色沉淀物。此反应称PAS阳性反应,PAS阳性部位为多糖存在部位。

2、脂类 

   标本用甲醛固定,冷冻切片,用油红O、尼罗蓝或苏丹类染料染色,使组织和细胞中的脂类物质显示相应颜色。亦可用锇酸固定兼染色,脂类呈黑色。

3、酶 

    酶细胞化学反应的基本原理是利用酶对其相应底物的水解、氧化等作用,使底物的反应产物被某种捕获剂捕获并在原位沉淀,形成有色的终产物,借此测定该酶在细胞内的分布及活性强弱。

4、核酸 

        显示DNA的传统方法是Feulgen反应(Feulgen reaction),组织切片或细胞涂片先经稀盐酸处理,使DNA水解,醛基暴露,再用雪夫试剂处理,形成紫红色反应产物。

(四)免疫组织化学术(immunohistochemistry)     

        利用免疫学抗原和抗体特异性结合的原理,检测组织或细胞中的多肽和蛋白质等大分子物质的分布。为显示抗原抗体复合物的存在,需进行抗体标记;用荧光素如异硫氰酸荧光素标记,可以在荧光显微镜下观察,用胶体金标记,可以在电镜下观察,用辣根过氧化酶标记,则可在光镜下或在电镜下观察。常用的方法有直接法、间接法和亲和素-生物素复合物法(ABC法)等。

荧光的观察(按标本分类)

    在荧光显微镜下观察的标本,当然必须发出荧光,可是大多数标本本身不能发出荧光,因而必须用荧光色素处理过才能发出荧光。

(A)自发荧光(不加染色)

(B)二次荧光(用化学染色)

(C)抗体荧光技术(用免疫染色)

(五)原位杂交术(in situ hybridization)

        通过检测细胞内mRNA和DNA分子序列片段,原位显示细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。应用某种已知的并被标记的RNA或DNA片段即核酸探针(cRNA或cDNA),与细胞内的待测核酸(RNA或DNA片段)进行杂交,通过标记物的显示在光镜和(或)电镜下观察目的mRNA或DNA的存在与定位(六)细胞和细胞化学定量术

1、显微分光光度测量术

应用显微光光度计,以物质分子对光波的选择性吸收为基础,在显微镜下对生物样品中的化学物质进行定量分析。

2、形态计量术

运用几何学和统计学原理,对组织或细胞进行二维和三维的形态测量研究,如对细胞的数量、体积、表面积和周长的相对和绝对值的测量等。

3、流式细胞术

是近年发展起来的细胞分类和定量研究技术,能对细胞的生物化学和生物物理特性进行快速定量测定,还可分选收集各种细胞。该技术的建立为细胞动力学、免疫学、血液学和肿瘤学等的研究提供了重要的研究手段。如细胞周期各时相细胞的比例,同步分析细胞内DNA、RNA和蛋白质的含量,T淋巴细胞亚群的分离和定量,淋巴细胞表面受体的分析,分离和浓缩造血干细胞,血细胞增殖情况,恶性肿瘤早期诊断,药物作用机制等。

(七)组织培养技术(tissue culture)

        是将离体的细胞、组织或器官置于培养基中,在无菌和适宜温度及酸碱度条件下进行培养成活,藉以观察各种物理、化学和生物因素对组织或细胞的作用,探索和提示细胞生命活动规律和细胞的结构功能变化。

新鲜实体组织细胞分离

                                    胶原纤维

1、酶消化法原理     紧密连接

                                    粘多糖

常用酶     蛋白酶类-胰酶:脂键、肽键

                                 -胶原酶:胶原

                                 -溶菌酶:糖蛋白和肽的糖苷键       血管

                                 -弹性蛋白酶:糖蛋白和弹性蛋白    心脏、 肝脏