蛋白上样缓冲液
PS:要测量的蛋白如果是磷酸化形式,一般加热到75度,一般情况可95度加热。市面上买到的SDS loading buffer 有2X的也有5X的,最后稀释至1X即可。
那么为什么我们加入SDS loading buffer呢?主要就是用它的不同成分在电泳中起了关键的作用。
SDS loading buffer 的主要成分及作用:A:0.1%溴酚蓝,作为指示剂,方便观察电泳进行的程度;B:10%甘油,密度大,增加样本的重量,可携带样本沉到底部;C:2%SDS,是一种阴离子表面活性剂,能打断蛋白质的氢键和疏水键,按一定比例和蛋白质分子结合成为复合物,是蛋白质带满负电荷,从而是蛋白带电荷一致,减少电荷对电泳结果的影响;D:巯基乙醇还原剂,使蛋白质的二硫键断开,使得蛋白保持线性结构。
4.电泳:接上电极(如图),正负极不要弄反,红色对红色,黑色对黑色,初始电压设为90V,当样品跑至分离胶时将电压调至120V,一般在溴酚蓝跑出胶时停止电泳,也可根据目的蛋白的分子量来选择跑的时间,如分子量较大,可以延长电泳时间,使得分子量大的marker跑的分散开,容易判断分子量。
1.蛋白样品上样量最好相等,不要过多。
2.不要过多重复使用电泳Buffer
3.最佳分辨区在分离胶的2/3
4.电泳后测定的分子量有10%的误差,不可完全信任。有些蛋白质由亚基(如血红蛋白)或两条以上的肽链(α-胰凝乳蛋白酶)组成的,它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链,SDS-PAGE电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量,有的蛋白质(如电荷异常或结构异常的蛋白质,带有较大辅基的蛋白质)不能采用该发测相对分子量。
5.如果电泳中出现拖尾,染色带的背景不清晰等现象,可能是SDS不纯引起。
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