蛋白桑:不同桑树品种的FT基因时空表达分析

【摘要】：植物开花诱导不仅关乎物种延续，而且与人类农业生产和经济生活密切相关。FT（FLOWERING LOCUS T）及其同源基因在植物开花诱导过程中整合多个调控途径的信号，起着关键信号分子的作用，从信号感受器官——叶片中传导至分生组织，诱导植物向生殖生长的转化，而且在多年生植物中FT基因可能与季节性休眠有关。因此，FT基因的表达受到日照长度，昼夜节律等多种环境信号的影响。但FT同源基因在多年生木本植物桑树中的成花诱导及休眠调控等方面的作用至今没有研究报道。对此开展研究对于促进遗传育种进程和提高桑果产量、调节休眠等环境适应性都有重要理论意义和实用价值。本试验通过对桑树的总RNA提取方法进行优化，对FT的年表达和日表达规律进行调查，以明确桑树的FT表达与成花调控的关系。对不同地理起源的桑树品种FT表达进行调查，分析FT基因在桑树休眠中的相关调控关系，为桑树FT基因的应用奠定了理论基础。 

本试验分为三个部分： 1.桑树干旱胁迫下生理指标的研究 为认识桑树旱害生理和分析抗旱性形成机制，利用5%PEG对桑树品种新一之濑进行模拟轻度干旱胁迫处理14天，复水培养至20天。测定了干旱对桑树叶片的相对含水量、相对导电率、脯氨酸和MDA含量的影响。结果表明，相对含水量在干旱胁迫下会持续下调，相对导电率、脯氨酸的含量以及MDA的含量都会在干旱胁迫下持续上调。在复水后这4个生理指标均会趋向于恢复干旱胁迫前的水平，但不会完全恢复，表明桑树可能存在干旱记忆。 

2.桑树总RNA两种Trizol提取的比较和改良以及FT基因实时定量PCR分析 对两种Trizol的RNA提取效果进行评价分析，筛选适合桑树的提取方法。按照说明书的操作步骤，对RNA得率和OD260/280进行测定，利用电泳对提取的RNA进行比较。 Invitrogen Trizol比Tiangen Trizol提取的RNA OD260/280更接近RNA提取的理想范围，电泳条带整齐，表明Invitrogen Trizol更适合于桑叶RNA的提取。同时比较发现适当增加异丙醇沉淀的时间可以提高RNA的纯度。本试验为桑树RNA抽提优化提供了基础数据。 FT基因表达严格受环境信号作用，为了解桑树在不同年份和不同光照条件下的FT基因表达规律。对6个品种FT基因的全年表达量规律进行了检测，结果表现为4-6月份逐渐上调，7月份表达量最高，8-11月份表达量逐渐下调。对桑树品种新一之濑和其诱变株系三倍体陕桑305的FT基因的全天表达规律进行了分析，在全年最高表达量的7月份，在晴天长日照的条件下在零点到3点有小幅下调，6点到15时呈现递增趋势，15时表达量到达峰值，18时到21时表达量逐渐下调；而在阴天/小雨的情况下，FT基因从零点到9点表达量逐渐下调，之后FT的表达量大体维持在一个稳态水平，没有明显的波动。由此可以推测长日照和较高温度可以使FT基因表达上调，在无直射光的条件下FT也会低活性地持续性表达。对不同地理起源的桑树品种进行的FT表达与日照长度进行分析，FT的不同时间表达量上具有明显的种间差异。新一之濑在生长周期内快速表达FT，其它品种FT的表达水平明显的低于新一之濑的表达水平；在5、6、9、10月份各个品种之间没有显著性差异；在7月新一之濑表达量最高，荷叶白表达量最低，其余品种差异不显著；在8月份707表达量最高，新一之濑和辽宁育8表达量次之，其余差异不显著；在11月份707和荷叶白表达水平明显低于辽宁育8、乌克兰、新一之濑和吴堡桑。因此可以推测不同物种在自主调节途径会明显地影响FT的表达。 

3.抗旱基因PMSR的克隆与表达 通过同源比对克隆了PMSR基因的部分表达片段，通过序列比对，能够证明其属于桑树多态甲硫亚砜还原酶，说明成功获得了基因的表达片段。通过对PMSR基因和Actin基因扩增条带的灰度值比较分析，可见干旱处理后第9天，桑叶中PMSR基因相对表达量显著升高。此基因表达趋势与先前的实验室干旱胁迫与对照的蛋白质双向电泳分析结果相一致，蛋白质水平和RNA水平均在受到干旱胁迫后出现了表达量升高。

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