瘤胃非降解蛋白小肠消化率测定方法及影响因素的研究

作者：王燕，张永根，李敏，李洋，辛杭书，刘立成，夏科，陈常栋，王志博

摘要：本试验采用移动尼龙袋法、原始的三步体外法和改进的三步体外法测定了不同产地10种饲料的瘤胃非降解蛋白（RUP）小肠消化率，并对体外法测定结果与移动尼龙袋法测定结果做相关分析，旨在研究产地对不同饲料RUP小肠消化率的影响及寻找替代移动尼龙袋法测定饲料RUP小肠消化率的简便方法。

试验材料选用不同产地豆粕、葵花粕、棉粕、菜粕、芝麻粕、大麦、麦麸、玉米、米糠、米糠粕。选用3头带有永久性瘤胃瘘管和十二指肠瘘管奶牛（体况良好，体重相似），瘤胃降解试验和移动尼龙袋试验均采用3×3拉丁方设计。

结果表明：产地对豆粕、芝麻粕、大麦、麦麸、米糠粕、玉米RUP小肠消化率有影响。改进三步体外法与移动尼龙袋法测定结果强相关（R2=0.8089，P<0.05）。改进的三步体外法替代移动尼龙袋法测定RUP小肠消化率是可行的。

关键词：蛋白饲料；能量饲料；小肠消化率

在反刍动物小肠中，可代谢蛋白质是由瘤胃合成的微生物蛋白、瘤胃非降解饲料蛋白（RUP）及少量内源蛋白构成。研究表明，微生物蛋白小肠消化率基本是固定的（80%~85%），但是RUP小肠消化率受饲料类型、饲料来源及加工方式等因素影响。饲料RUP小肠消化率是影响奶牛的产奶量、生产性能的重要参数。

目前，蛋白评价系统对不同饲料的RUP小肠消化率均采用固定值，在英国饲料评价系统、NRC体系中，所有饲料的RUP小肠消化率分别均为90%、80%。这种状况对不同饲料显然具有很大局限性。目前，测定饲料RUP小肠消化率主要有移动尼龙袋法、原始的三步体外法和改进的三步体外法，但由于动物福利及瘘管牛成本较大等原因，移动尼龙袋法不能广泛应用。

近年来，随着生理生化、酶学的发展，体外法也逐渐被人们所接受，三步体外法是在特定温度和pH条件下用一种酶或多酶复合物培养饲料样品，这种方法成本低、易操作、重复性好。本试验采用移动尼龙袋法（MBT）、改进的三步体外法（MTSP）和原始的三步体外法（TSP）测定了不同产地10种饲料的RUP小肠消化率，并将原始的三步体外法和改进的三步法测定的结果与移动尼龙袋法测定结果做相关分析，旨在探讨产地对饲料RUP小肠消化率的影响及体外法替代移动尼龙袋法测定RUP小肠消化率的可行性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

瘤胃降解试验、移动尼龙袋试验、原始的三步体外法及改进的三步体外法的试验材料均选用豆粕（建三江农场、九三农场、工大集团）、棉粕（山东、新疆、吉林）、菜粕（辽宁、山东、河北）、葵花粕（山东、河北、新疆）、芝麻粕（河南、山东、辽宁）、玉米（黑龙江、吉林、山东）、大麦（黑龙江、吉林、河南）、米糠（黑龙江、吉林、辽宁）、米糠粕（黑龙江、吉林、辽宁）、麦麸（内蒙古、黑龙江、辽宁）这30个饲料样本。待测样品，粉碎过40目筛保存备用。

1.2 试验动物和饲粮

试验动物选用3头带有永久性瘤胃瘘管和十二指肠瘘管的荷斯坦奶牛，采用3×3拉丁方设计。参照Woods等方法对饲料进行16h瘤胃培养，每天饲喂2次奶牛，每次饲喂4kg精料，羊草自由采食。精料配方：每千克日粮235g大麦、200gDDG、150g菜籽粕、140g葵花粕、110g米糠粕、60g糖蜜、55g甜菜粕、20g矿物质和维生素。

1.3 试验方法

移动尼龙袋法测定饲料RUP小肠消化率，具体步骤参照Hvelplund的方法。原始三步法参照Calsamiglia等原理和方法测定，改进的三步体外步骤如下：将装有瘤胃培养16h残渣的尼龙袋取出，清洗至水清，在55℃烘箱内烘48h，制成风干样后过40目筛。称1g残渣放入尼龙袋里（AnkomR510，孔径50μm），热封。

每个培养瓶内放3个袋子，瓶内放入预培养的pH=1.9盐酸胃蛋白酶溶液，其中含有1g胃蛋白酶（Sigma，P-7000），在39℃培养箱内振荡培养1h。培养后，冲掉所有的液体，用自来水冲到澄清为止。把袋子放入培养瓶中，加入2L预热的胰蛋白酶溶液（pH=7.75，KH2PO4缓冲溶液），每升溶液含有50μg/L百里香酚和3g胰蛋白酶（SigmaP-7545）。在39℃培养箱内振荡培养24h。培养后，清洗小尼龙袋，直至水清，在55℃烘箱内烘48h，测定含氮量。

1.4 计算方法

1.4.1 RUP小肠消化率（移动尼龙袋法）

RUP的小肠消化率=（瘤胃非降解蛋白含量－小肠消化后残渣中蛋白含量）/瘤胃非降解蛋白含量×100%。

1.4.2 RUP小肠消化率计算方法（原始的三步体外法和改进的三步体外法）

RUP的小肠消化率=酶解体系中的可溶性氮/瘤胃非降解氮×100%。

1.5 统计分析

采用SAS软件包进行统计分析，以GLM过程分析移动尼龙袋法所测不同产地饲料RUP小肠消化率间的差异性；以PROCREG过程对移动尼龙袋法与原始的三步体外法、改进的三步体外法所测蛋白质小肠消化率数据进行线性回归分析。

2 结果与分析

2.1 不同产地对每种饲料的RUP的小肠消化率的影响

由表1可见，产地对豆粕、芝麻粕、大麦的RUP小肠消化率影响极显著（P＜0.01），产地对麦麸、米糠粕、玉米的RUP小肠消化率影响显著（P＜0.05），而产地对棉粕、菜粕、米糠和葵花粕的RUP小肠消化率影响不显著（P＞0.05），这与Woods等得出关于产地对豆粕和菜粕的RUP小肠消化率的有显著影响的结论一致。

表1 同种饲料不同产地对RUP小肠消化率的影响 g•kg-1

注：NS表示不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。下表同

2.2 3种方法测定的饲料RUP小肠消化率的相关性分析

由表2可以看出，除玉米、米糠粕和麦麸以外，其余饲料移动尼龙袋法测定的RUP小肠消化率和改进的三步体外法测定结果无显著差异（P>0.05）。在所有饲料中，改进三步体外法与移动尼龙袋法测定结果有较强相关y=1.08x-105.23（R的2次方=0.8089，P＜0.05）。

在蛋白饲料中，改进的三步体外法和移动尼龙袋法测定结果无显著差异，存在极显著的相关y=0.98x+11.76（R的2次方=0.9648，P＜0.05）。在能量饲料中，改进的三步体外法测定结果和移动尼龙袋法测定结果也存在显著相关y=0.99x-54.08（R的2次方=0.8069，P＜0.05），但2种方法对能量饲料测定结果的相关系数明显低于蛋白饲料。

移动尼龙袋法测定的所有饲料的测定结果与原始三步体外法的测定结果也存在相关，但相关性不高（R的2次方=0.7127，P＜0.05）。对于蛋白饲料，原始的三步体外法和移动尼龙袋法测定结果存在显著相关y=0.91x-29.19（R的2次方=0.7719，P＜0.05），2种方法能量饲料测定结果的相关系数明显低于蛋白饲料，说明原始的三步体外法和改进的三步体外法测定蛋白饲料的RUP小肠消化率比测定能量饲料RUP小肠消化率准确。

表2 3种方法测定的饲料的小肠消化率的相关性分析 g•kg-1

注：1MBT，2MTSP，3TSP，vs是2种方法测定值的比较

3 讨论

3.1 饲料产地对RUP小肠消化率的影响

饲料产地对每种饲料的RUP小肠消化率影响不同。产地不同包括很多因素，主要可能与加工方式、饲料品种、气候条件等因素有关。当购买某种饲料时，同等价格的情况下，选用RUP小肠消化率高的饲料能有效提高经济效益，因此准确测定不同产地的同种饲料对于采购饲料具有非常重要的意义。

本试验用移动尼龙袋法测定的豆粕RUP小肠消化率是972~991g/kg，这与Woods等用移动尼龙袋法测定的豆粕小肠消化率的结果相似（966~985g/kg）。

Frydrych用移动尼龙袋法测定不同产地的大麦的RUP小肠消化率是914~954g/kg，而本试验测定的RUP小肠消化率为868.52~918.5g/kg，这种差异很可能是由于大麦蛋白含量低，瘤胃可降解蛋白含量高，合成瘤胃微生物蛋白较多的缘故，也可能与大麦的品种有关。产地对芝麻粕RUP小肠消化率有显著影响，这可能与芝麻粕的加热程度和脱油程度有关。

3.2 比较不同方法测定的饲料RUP小肠消化率

在本试验中，原始的三步体外法测定的结果与赵青余用原始的三步体外法测定的豆粕、棉粕、菜粕、玉米和小麦麸的结果均相近，但是用移动尼龙袋测定的结果除豆粕外，棉粕、菜粕、玉米和小麦麸均偏高，这可能是由于饲料原样的特性（CP、NDF、ADF等的含量）不同所致。

赵青余认为，体外法测定小肠消化率的结果与移动尼龙袋法测定的小肠消化率的结果存在显著相关，岳群等也得出同样的结论，这表明采用体外法可以替代移动尼龙袋法来评价饲料的小肠消化率。Antoniewicz等用2种方法比较5种不同甲醛水平的蛋白质饲料，结果表明体内、体外法有很高的相关（R的2次方=0.90）。

VanStraalen等也报道这2种方法有很强的相关（R的2次方=0.90），这意味着用体外法替代体内法是可行的。Woods等测定了豆粕、葵花粕、菜籽粕、棉粕、棕榈粕、大麦等12种饲料的RUP小肠消化率，得出2种方法的测定结果有很强的相关（R的2次方=0.9102）。Gargallo等建立了改进的三步体外法，并得出原始的三步体外法和改进的三步体外法有较强的相关（R2=0.8301）。

本试验得出原始的三步体外法和改进的三步体外法均能替代移动尼龙袋法测定RUP小肠消化率，但是改进的三步体外更准确，尤其对于蛋白饲料，这主要是由于改进的三步体外法消除了三氯乙酸（强腐蚀性、强氧化性）对试验的影响。

另外，改进的三步体外法采用水浴振荡器的转速高（200r/min），与原来的三步法相比能更充分地与小肠液接触，与体内环境更相似，因而改进的三步体外法可以替代移动尼龙袋法。而改进的三步法选用纯度低的胃蛋白酶（P-7000，Sigma），比高纯度的胃蛋白酶（P-7012，Sigma）价格降低22倍，这样大大节约了成本。

4 结论

不同种饲料的RUP小肠消化率是不同的。产地对豆粕、芝麻粕、大麦、麦麸、米糠粕、玉米RUP小肠消化率有影响。改进的三步体外法替代移动尼龙袋法测定小肠消化率是可行的。

责任编辑：小镖

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