质谱创新应用于蛋白质和多肽类药物生物分析的研究进展

2023-05-18 23:00:13

近年来，生物药在自身免疫性疾病、炎症、癌症、心血管疾病以及罕见遗传病等疾病的治疗方面展现出巨大潜力，其重要性受到越来越多的关注。这些极具前景的生物药由于其毒性低、特异性高而成为重要的候选药物，包括非常小的肽链（如胰岛素）和大分子蛋白质（如抗体、新型Fc样融合蛋白）。许多制药公司正在大力开展这些化合物的临床前和临床研究。


生物药物的巨大成功体现在它的迅速增长，其全球市场估值在2013年为1997亿美元，到2020年预计增长13.5%。过去十年里，生物药物发展迅速，临床已批准的蛋白质和多肽类药物超过170个，目前有350个抗体药物即将进入临床试验。随着行业的关注度和投资的不断上升，以及医学界对这些独特的靶向性治疗药物的需求的不断增加，当前迫切需要开发高通量分析技术来拓宽生物药物的产品线。


为了能达到监管部门要求，将生物药的开发和发现推进到临床试验阶段，需要对候选药物开展代谢研究。这类研究涉及的药代动力学（PK）、毒代动力学（TK）、生物等效性和临床药物监测研究，都需要精确的定量分析，并且所面对的都是复杂的生物样品（血液、血浆、或尿等）。生物药物增长快速，伴随的是对分析平台的大量需求，这些平台需要灵活、稳定且易于整合到已有的药物开发工作流程中。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术已经广泛应用于小分子药物开发，近年来，分析检测技术的发展也已对生物分析产生重大影响。我们在这里将介绍SCIEX质谱的核心技术如何整合简单选择性强、高灵敏度以及高通量定量等优点。 LC-MS/MS已被公认是众多领域（如蛋白质组学、兴奋剂检测、法医学和临床化学等）的定量生物分析首选，它也最终将取代并超越其他的生物药分析技术。


目前蛋白质和多肽定量的标准惯例是基于配体的结合试验（LBA），如酶联免疫吸附试验（ELISA），或用高压液相色谱法（HPLC）分离单个多肽然后再紫外检测。配体结合试验依赖于目标蛋白或多肽上的特异抗原表位的免疫亲和性，虽然根据抗体相互作用的高特异性可以高灵敏度地检测分析物，但是它的检测范围只有一个或两个数量级。特异抗体的制备过程较为漫长，导致分析方法的开发耗时并且价格昂贵。此外，抗体交叉反应产生的高背景常常干扰配体结合试验的结果。多肽的紫外检测和定量通常用于肽谱分析，该方法适用于大量样品的制备和纯化后的分析。


虽然HPLC联用紫外检测不会像生产抗体那样昂贵和费时，但是随着样品基质复杂性的增加，该方法的适用性大大受限。我们在这里将详细介绍应用SCIEX质谱仪定量多肽的技术，展示如何实现高灵敏和高选择性的检测，包括高背景噪音情况下。


多肽生物分析方法必须足够灵敏，才能达到准确度和精密度的高标准，进而满足定量生物分析标准和方法验证的要求。在第一部分中，我们将通过在SCIEX QTRAP®6500系统和Triple Quad™ 6500系统上进行的评估实验来挖掘系统的最高灵敏度。样品内在的复杂性往往会导致高背景噪音和干扰峰，进而会对生物分析产生不利影响。第二部分说明如何利用创新技术在含有多种丰富内源性蛋白质的生物样品中实现对待测物的高选择性，例如3级多反应监测（MRM3）技术和SelexION™差异化离子分离技术。第三部分，我们详细总结了高分辨质谱的研究进展，重点介绍了TripleTOF®5600+系统的靶向工作流程，用极窄的提取窗口和高分辨率TOF数据极大提高了定量检测的灵敏度和选择性。第四部分，我们介绍了用于多肽定量的软件，它可以向研究人员提供可靠的流程，以实现复杂并需多步计算的色谱峰积分。


该书的章节和实验部分概述了生物分析技术的关键挑战、优势和特点。便于质谱技术和其他生物分析工具作比较，以发现其更多的优点。LC-MS/MS分析技术为生物药物的开发提供了许多有力的支持; 尽管LC-MS/MS分析技术在小分子实验室已经占据主导地位，但将其纳入到生物制药流程中的进展仍然很缓慢。LBA技术所需的基础设施投资相对较少，并且易于实现高通量，其应用广泛且容易验证，因此LBA技术仍然是蛋白质和多肽生物分析领域最受欢迎的方法。尽管如此，LBA方法也有它的缺点，探索更加直接的LC-MS/MS替代方案将可以加速生物药物治疗产业的进一步发展。 


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质谱创新应用于蛋白质和多肽类药物生物分析的研究进展

中文，全文5页， 该篇文章是“ Biologics Bioanalysis Compendium"一书的第一篇综述，点击标题，查看全文。 


Biologics Bioanalysis Compendium

英文，全文106页，4个方向20篇文章。


第一部分，样品内在的复杂性往往会导致高背景噪音和干扰峰，进而会对生物分析产生不利影响。 我们将通过在SCIEX QTRAP®6500系统和Triple Quad™ 6500系统上进行的评估实验来挖掘系统的最高灵敏度。


第二部分，说明如何利用创新技术在含有多种丰富内源性蛋白质的生物样品中实现对待测物的高选择性，例如3级多反应监测（MRM3）技术和SelexION™差异化离子分离技术。


第三部分，详细总结了高分辨质谱的研究进展，重点介绍了TripleTOF®5600+系统的靶向工作流程， 用极窄的提取窗口和高分辨率TOF数据极大提高了定量检测的灵敏度和选择性。


第四部分，介绍了用于多肽定量的软件，它可以向研究人员提供可靠的流程，以实现复杂并需多步计算的色谱峰积分。


多肽生物分析的主要挑战

制药行业为什么还在犹豫是否要完全采纳基于LC-MS/MS的多肽定量分析策略？要想回答这个问题，就必须充分了解其工作流程的复杂性和面临的挑战（有关LC-MS/MS技术应用于蛋白质和多肽定量的优秀综述请参见表1）。蛋白质和多肽定量：可通过标准校准曲线法计算生物样品中未知物的浓度，此外，收集的数据必须足够可靠以达到美国FDA规定的严格标准。对于治疗性多肽，可以省略蛋白水解步骤，在相对有限的样品制备步骤后通过MS/MS技术直接定量完整的多肽（图1）。分析较大分子量的生物药物（> 10kDa）时，因为其更复杂，直接用MS/MS技术分析整个分子并不一定合适。因此，更大分子量的蛋白质和抗体的生物分析是基于蛋白质肽段的定量分析，通常是利用胰蛋白酶消化酶切，选择特征性的肽段，它具有区别于消化产物中其他多肽的独一无二质荷比m/z。当与稳定同位素标记（SIL）的内标偶联时，特征多肽与SIL内标的响应比率即可代表完整蛋白质的浓度。想要建立这样一种涉及多方面的生物分析方法，并且达到合规的标准，非常具有挑战性，因此很容易理解为什么生物药物的LC-MS/MS定量技术在GLP实验室中开展地很慢的原因。


图1. 肽和蛋白质生物分析工作策略。蛋白质定量通常涉及胰蛋白酶消化步骤，而在完整多肽定量时可以省略该步骤，从而简化了定量过程。



对于LC-MS/MS生物分析的评估表明，实现准确和精密定量的主要挑战在于样品制备过程，包括：1）用于产生特征多肽的过程冗长且流程复杂，2）由于背景干扰，成分极其复杂的生物样品的定量准确度降低。多步还原/烷基化/消化过程会产生比初始样品更加复杂的混合物，这使低浓度水平治疗性多肽的生物分析极具挑战性。在低浓度范围内（ng/mL）获得LLOQ的关键在于优化样品制备过程。样品制备过程中需要考虑大量的竞争性背景多肽，因此通常需对分析物富集或半纯化，因而在工作流程中引入更多的复杂性。


从合规的角度来看，需关注靶蛋白消化过程中释放的可变多肽，如果不能很好地控制或补偿消化条件，那么这些不规则的特征多肽对整体数据的质量将会产生持久影响。为了克服这些缺点，可采用诸如冷却样品制备步骤和优化消化步骤等策略，这使得方法的开发更加直接，从合规角度看，因而具有更广泛的吸引力。此外，技术的进步为直接定量亚皮摩尔浓度范围内的样品提供了非常灵敏和具有选择性的质谱工作流程，这样可以进一步简化样品制备方案，而不依赖于富集复杂样品或降低基线，这将有助于推动这种适用面广 且可靠的MS方法稳步地进入到合规的生物药物定量分析领域。


接下来总结一下目前LC-MS/MS应用于多肽定量所面临的一些挑战

  • 定量范围有限 — MS/MS灵敏度、选择性差可能影响所需的最低定量下限（LLOQ）。

  • 基质复杂导致灵敏度下降— 生物样品中高背景和竞争性离子可影响极低浓度水平（亚pg/mL）的多肽检测。目前已报道的最低LOQ是100pg/mL，这还不足以用于缓释药代动力学的研究。

  • 专属性差 — 复杂的生物基质导致数据分辨率下降，因而需要复杂的样品制备过程和/或更高性能的仪器设备

  • 同时洗脱出来的多电荷干扰物阻碍了准确的定量和在LOQ水平的色谱峰积分。

  • 同重元素的干扰会影响测定方法的选择性和特异性，导致生物分析方法开发过程中产生准确识别等有关问题。

  • 回收率低，灵敏度差— 多肽的吸附特性和/或极性影响样品的回收率，且生物基质的干扰对灵敏度和选择性也会产生不利影响。

  • 多肽的一些具有挑战性的物理化学性质（如非特异性结合、溶解性差、以及复杂电荷态包络结果等）导致定量方案设计会出现问题。

  • MRM选择性受限— 在定量限内，由于同重元素的干扰或高基线噪音，可能会导致MRM和高效UHPLC分离方法在LLOQ水平的信噪比较低。

  • 系统测量误差 — 特别是超低浓度定量，测量误差对数据的精密度和准确度有显著影响。

  • 多肽不能有效裂解— 环状多肽片段通常不能有效裂解，只能产生少量子离子用于MRM分析。


质谱法用于多肽定量分析的主要优点

虽然目前工业界主要采用配体结合试验法（LBA），但LC-MS/MS技术提供了许多潜在的益处，它是通过对待测物的化学性质进行直接评价，而不是利用免疫相互作用的间接信号。通过LC-MS/MS方法获得的定量数据与来自LBA法的浓度具有良好的相关性。


LBA方法要求每种待测物都有特异性抗体，而质谱平台与LBA法不同，它具有普遍适用性，因此为多种多样的待测物提供了一种分析技术。LC-MS/MS法不仅可以实现所有类型的蛋白质和多肽的检测，还可以测定很多其他类型的生物分子（例如脂质体、碳水化合物等），这为研究人员提供一个可识别非蛋白杂质的灵活平台。由于自身抗体交叉反应和每种目标蛋白商品化试剂盒的缺乏，LBA在其适用性方面受到很多限制。LC-MS/MS能够克服非特异性结合和分子种类的限制，甚至可以定量测定使用免疫亲和技术不可能区分的高度同源的亚型。低浓度的生物分子定量犹如大海捞针，而LC-MS/MS能够在较宽的动态线性范围内（通常3至4个数量级以上）提供精密度和准确度良好的定量数据。此外，与抗体生产的重复花费和耗时特点相比，我们可以在相对较短的时间内同时开发并验证用于多目标分析物的LC-MS/MS方法。所有这些特点结合在一起，即灵活性、良好的数据质量和高度选择性，使LC-MS/MS成为合规实验室中生物药物定量的一种极具吸引力的方法。  


用于MS/MS多肽定量仪器的主要特点

虽然样品制备步骤的不断优化会改善LC-MS/MS的定量过程，但蛋白质和多肽定量的显著进步还是要通过质谱技术的创新来实现。 SCIEX专注于提高灵敏度和选择性，以及检测超复杂背景下的极低浓度水平蛋白质和多肽，并推出能同时快速测量多种待测物的高性能仪器，为未来的药物发现和开发提供强大支持（图2）。


基于多个正交选择性工具的蛋白质/多肽生物分析选择性更多

图2. 运用质谱的附加的正交选择性工具，增加样品分析的选择性，如SelexION（差分迁移分离装置），QTRAP LC-MS/MS系统上的MRM3扫描功能和Sheduled MRM等提高占空比。


1
灵敏度

生物药物活性很高，高度靶向药物的给药剂量低，并且治疗范围窄。体内循环中的药物浓度通常在亚ng/mL的浓度范围内，因此生物药物的研究需要超高灵敏度的检测方法，提高电离效率和离子传输率可以检测亚飞克级水平的药物和代谢产物。SCIEX 的TRAP® 6500系列和Triple Quad™ 6500系列采用很多新技术，例如IonDrive™ QJet® 离子导向组件改善离子容量和碰撞聚焦，使更多的离子进入检测器，增强灵敏度。改进IonDrive™ Turbo V™离子源优化的加热设计和增强气流效果改善去溶剂化，可以产生更多离子进入质谱仪。为了能充分检测增强的信号，检测器动态范围的提高可实现精准的离子计数，高能转换电极（HED）检测系统能检测高的离子信号且不会过饱和，大幅度提高了动态线性范围，可达6个数量级。这些技术为灵敏的生物分析方法的不断优化提供了关键支持。


2
选择性

即使灵敏度达到最高，研究人员仍然面临从高度复杂的生物基质中分离低浓度具有治疗活性生物分子的挑战，基质中每一个内源性化合物都可能会干扰目标信号。虽然样品前处理过程中有一些方法可以富集待测物或选择性去除竞争性背景离子，但所耗费的时间和附加清洗步骤带来的样品损失使这种方法不具有吸引力。目前，MS选择性的改善主要是通过进入MS后进行一定程度的分离或者MS/MS完成后再进行选择，从而提高在高度复杂生物基质中分离样品的能力，最终提高选择性。在检测高背景掩盖下的低浓度待测物时，SCIEX公司通过推出MRM3扫描技术和SelexIon™差分离子淌度分离装置来改善蛋白质和多肽定量时的峰形和信噪比，以实现在高背景干扰下的低浓度分析检测，从而最大限度地发挥仪器性能。


MRM3

通过多反应监测（MRM）扫描技术获得的峰面积测量偶尔会受到干扰，若样品不经过进一步更精细的纯化，这种干扰就不会消除。超灵敏的混合三重四极杆—线性离子阱QTRAP系列质谱仪采用MRM3技术，通过对一级的子离子再进一步碎裂，使其特异性增强。用再次碎裂产生的二级子离子定量通常不受竞争离子或重叠离子的影响，因为在前面的MRM步骤已经过滤一次。这种基线降低能够改善峰形、提高信噪比和LLOQ。QTRAP® 5500和6500系统采用eQ™电子学技术，以确保系统具有超快扫描速度，可以匹配快速的LC流速; 并且这些仪器配备单频激发，以确保二级碎裂之前子离子的最高选择性。凭借线性加速器离子阱（LinearAccelerator™ Trap）技术，用MRM3方法检测低浓度再次碎裂的碎片离子，检测灵敏度提升了100倍，解决了高背景噪音问题。


差分迁移质谱法（DMS）

如果二级子离子特异性不强，或其浓度太低以至于不能使用MRM3扫描；或者方法开发时间有限，不能继续耗时在MRM3方法开发上，这时可通过差分迁移质谱法（DMS）来增加选择性。该技术根据两个平板电极间高低场之间的淌度差异来进行分离，选择目标离子，在分析物进入质谱仪之前消除共洗脱干扰。SCIEX推出SelexION™差分迁移分离装置，特别适合于分离同分异构体以及消除单一/多重电荷干扰，从而提高难以定位的重叠峰在正交水平的分离，所有这一切均能在超高压液相色谱分析 (UHPLC) 的保留时间内以及各种多反应监测 (MRM) 下完成。


3
高分辨率精确质量数质谱

除了以上方法外，还可以通过仪器上的高分辨率质谱提高选择性，如SCIEX TripleTOF® 5600+系统，在同一平台上集成了全面定性检测和高分辨定量工作。当启动MRMHR工作流程时，TOF分析仪会以高分辨率和高精确度完成来自母离子的所有碎片的检测。


采用较窄的提取窗口（比三重四极杆的单位分辨率更窄），可以实现背景峰和分析峰之间的分离，从而降低干扰程度。利用这些窄的提取窗口提取碎片离子，可提高复杂基质中待测物检测的准确性和特异性。


4
 软件

蛋白质和分析通常比较耗时且需要重复劳动，手动识别目标峰和整合数据显然不适合应用于高通量的工作。因此SCIEX开发了全面、功能强大且易于使用的软件，如MultiQuant™和DiscoveryQuant™，这些软件可同时处理多种待测物，不仅能快速处理MS扫描和数据，还能够提高数据的完整性和安全性，并采用独特的审计追踪功能以提高合规性，嵌入式数字链被整合到Watson LIMS系统以增强数据的安全性。


质谱系统多样性的优点

本书中，我们主要介绍了TripleTOF 5600+系统与QTRAP 6500系统的仪器。这两个平台各具有显著优势（如图3）：TripleTOF由于能获得二级碎片的高分辨全扫描图谱，因而特别适用于定性研究（也适用于定量研究），而QTRAP系统由于其增强的离子生成、传输及检测，因而最能满足需要高灵敏度和宽线性范围应用的要求。SCIEX QTRAP 6500系统可完全用于I期及后期临床试验中的合规生物药物分析，而TripleTOF系统在新药研发阶段的快速方法开发和非靶向分析中占据主导地位。有些场合，一项应用需要利用备选质谱平台的某种优势和强项，那么不同平台之间的转移应当是简便且直观的；这两个质谱系统具有相同的离子源和具有基于创新线性离子加速碰撞室LINAC®技术，因此能将定量数据与定性分析无缝衔接（如图4）。


用于蛋白质/多肽生物分析的TripleTOF系统与QTRAP系统的比较

图3. 运用于多肽定量的质谱平台比较。


从对生物分子的表征研究到生物转化和生物分析

图4. TripleTOF与QTRAP之间连续的工作流程。研究和开发过程中的产品表征研究到临床前和临床阶段PK / PD分析中的生物转化和生物分析。


展望未来

随着技术创新超越了生物样品复杂性所造成的限制，基于LC-MS/MS技术的生物药物定量方法将在合规实验室中作为常规方法被完善地建立。耗时且复杂的样品制备步骤将会演变成更适合于MS生物分析工作流程的自动化操作，并且样品提取过程可能变得具有更高选择性，以达到检测亚皮摩尔浓度的生物药物所需要的灵敏度。基于增强MS电离和传输效率的高灵敏度方法在QTRAP系统中已取得了可喜的成果，它已经能提供足够的LLOQ，用于PK和TK研究中所需的低浓度生物分子定量。此外，采用DMS和MRM3的技术将会提高选择性，消除难以分离的背景，从而提好信噪比。由于技术进步推动TOF的灵敏度接近混合线性离子阱仪器，高分辨率质谱在测量完整大分子生物分子方面将会受到越来越多的关注。通过增强MS检测能力和选择性来减少对额外样品制备步骤的需求， LC-MS/MS技术越来越匹配合规生物分析所需要的高通量工作流程。


备注：该篇文章是“Biologics Bioanalysis"一书中的第一篇综述，后续书中文章会陆续翻译推送。感谢复旦大学药学院相小强老师和张洪艳同学的辛苦付出！

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