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SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白实验+一本好书《灿烂千阳》

生物匠ArtisanBio 2018-11-21 16:53:40

实验原理

SDS-PAGE是对蛋白质进行量化,比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子 量不同来进行分离的。

SDS是一种去垢剂,可与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子 量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后,电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。

材料与试剂

(1)5x样品缓冲液(10ml):0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油,2ml 10%的SDS,0.5ml β-巯基乙醇,1ml 1%溴酚蓝,0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周,或在-20℃保存数月。

(2) 凝胶贮液:在通风橱中,称取丙烯酰胺30g,甲叉双丙烯酰胺0.8g,加ddH2O 溶解后,定容到100ml。过滤后置棕色瓶中,4℃保存,一般可放置1个月。丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸,这一脱氨基反应是光催化或碱催化,故溶液的pH值不超过7.0,应置于棕色瓶中4℃保存。

(3)浓缩胶缓冲液: Tris 5.98g ,加1mol/L HCl 48ml,加ddH2O 80ml使其溶解,调pH6.7,定容至100ml, 4℃保存。

(4)分离胶缓冲液: Tris 36.3g ,加1mol/L HCl 48ml,加ddH2O 80ml使其溶解,调pH8.9,定容至100ml, 4℃保存。

(5)10%十二烷基硫酸钠(SDS):称取10gSDS加去离子水90ml加热至68℃,加几滴浓盐酸调节至pH7.2加水至100ml,即为10%(w/v)SDS。

(6)10%过硫酸胺(AP):过硫酸胺提供催化丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基,可用去离子水配制小量10%(W/V)贮存液并4℃保存。由于过硫酸胺会缓慢分解,故应隔周新鲜配制。

(7)TEMED(N , N , N, N -四甲基乙二胺)TEMED通过催化过硫酸胺形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合,由于TEMED只能以游离碱的形式发挥作用,因此pH值较低时聚合反应受到抑制。

(8)Tris-甘氨酸电极缓冲液:称取Tris 6.0g,甘氨酸28.8g,加蒸馏水约900ml,调pH8.3后,用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存,临用前稀释10倍。

(9)考马斯亮蓝G250染色液:称100mg考马斯亮蓝G250,溶于200ml蒸馏水中,慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸,最后补足水到250ml,搅拌1小时,小孔滤纸过滤。

(10)聚丙烯酰胺凝胶电泳槽和电泳仪

(11)加样器和吸头等

操作方法

1. 样品制备

将蛋白质样品与5X样品缓冲液(20ul+5ul)在一个eppendorf 管中混合。放入100℃加热5-10min,取上清点样。

2. 分离胶及浓缩胶的制备

① 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净,用ddH2O冲洗数次,再用乙醇擦拭,晾干;

② 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer,按照Bio-Rad Mini Ⅱ/Ⅲ说明书提示装好玻璃板;

③ 按如下体积配制10%分离胶8.0 ml,混匀:ddH2O 3.0 ml;1.0 mol/LTris-HCl pH 8.8 2.1 ml;30% Acr-Bis 2.8 ml;10% SDS 80 ul;10%AP 56 ul;TEMED 6 ul。

④ 向玻璃板间灌制分离胶,立即覆一层ddH2O ,大约20 min后胶即可聚合;

⑤ 按如下体积配制6%浓缩胶3.0 ml,混匀:ddH2O 1.0 mol/LTris-HClpH 6.8 30% Acr-Bis;2.0 ml 400 ul 600 ul;10% SDS 10% AP TEMED;36ul 24ul 4ul。

⑥ 将上层重蒸水倾去,滤纸吸干,灌制浓缩胶,插入样品梳;

⑦ 装好电泳系统,加入电极缓冲液,上样20 μl;

⑧ 稳压200V,溴酚蓝刚跑出分离胶时,停止电泳,时间约为45-60min。

⑨ 卸下胶板,将分离胶放入染色液中,常温染色1~2 h,然后加入脱色液,置于80 rpm脱色摇床上脱色,每20 min更换一次脱色液(10 ml 冰乙酸;45 ml乙醇;45 ml蒸馏水)至完全脱净。




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一本好书


《灿烂千阳》


内容简介 

私生女玛丽雅姆在父亲的宅院门口苦苦守候,回到家却看到因绝望而上吊自杀的母亲。那天是她十五岁的生日,而童年嘎然而止。玛丽雅姆随后由父亲安排远嫁喀布尔四十多岁的鞋匠拉希德,几经流产,终因无法生子而长期生活在家暴阴影之下。

十八年后,少女莱拉的父母死于战火,青梅竹马的恋人也在战乱中失踪,举目无亲的莱拉别无选择,被迫嫁给拉希德。两名阿富汗女性各自带着属于不同时代的悲惨回忆,共同经受着战乱、贫困与家庭暴力的重压,心底潜藏着的悲苦与忍耐相互交织,让她们曾经水火不容,又让她们缔结情谊,如母女般相濡以沫。然而,多年的骗局终有被揭穿的一天……

她们将做出如何的选择?她们的命运又将何去何从?

关于不可宽恕的时代,不可能的友谊以及不可毁灭的爱。《灿烂千阳》再次以阿富汗战乱为背景,时空跨越三十年,用细腻感人的笔触描绘了阿富汗旧家族制度下苦苦挣扎的妇女,她们所怀抱的希望、爱情、梦想与所有的失落。

书    评

◎人们数不清她的屋顶上有多少轮皎洁的明月,也数不清她的墙壁之后那一千个灿烂的太阳。

◎比追风筝的人好看,虽然作者依旧亲美,但是已经比上一本收敛多了。上次是一群男主角,这次是一群女主角。这几个女人的不幸遭遇背后是整个阿富汗(或者说是极端教义下的穆斯林)女性的不幸。男性也有不幸,但相对于不能掌控自己命运的活受罪来说,被利用战死也算是还好吧。情节算是比较跌宕起伏的了,可读性很强。由于前面不少的铺垫让后来那封信努戳泪点。唉。“我跟你说这些话,是想让你知道害怕是正常的反应。你不用为此觉得羞愧。”

◎读胡赛尼的书,总有一个感觉:阿富汗曾经真的是一个很美的地方。因为战争……毁了这一切……

◎当我们带着最后的顽强和希望穿越冗长的黑暗,幸存下来的疲惫身躯会在阳光的照耀下变得温暖而坚实。

◎比《追风筝的人》文字更成熟。同样是戳中泪点,的确比《追》的为惨而惨这本更是平淡地用情节用感情打动人。“人生就是这样,在心碎之后,我们还得忍受一次又一次的悲伤。” 我们怎样来到这个世界并不重要,重要的是在离开的时候是一个付出了爱也得到了爱的人,这样就足够了吧。


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