SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白实验+一本好书《灿烂千阳》

SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子 量不同来进行分离的。

SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子 量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。

（1）5x样品缓冲液(10ml)：0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8)，5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml β-巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在-20℃保存数月。

（2） 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加ddH₂O 溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反应是光催化或碱催化，故溶液的pH值不超过7.0，应置于棕色瓶中4℃保存。

（3）浓缩胶缓冲液： Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加ddH₂O 80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml， 4℃保存。

（4）分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加ddH₂O 80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。

（5）10%十二烷基硫酸钠（SDS）：称取10gSDS加去离子水90ml加热至68℃，加几滴浓盐酸调节至pH7.2加水至100ml，即为10%（w/v）SDS。

（6）10%过硫酸胺（AP）：过硫酸胺提供催化丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基，可用去离子水配制小量10%（W/V）贮存液并4℃保存。由于过硫酸胺会缓慢分解，故应隔周新鲜配制。

（7）TEMED（N ， N ， N, N -四甲基乙二胺）TEMED通过催化过硫酸胺形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合，由于TEMED只能以游离碱的形式发挥作用，因此pH值较低时聚合反应受到抑制。

（8）Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍。

（9）考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。

（10）聚丙烯酰胺凝胶电泳槽和电泳仪

（11）加样器和吸头等

1. 样品制备

将蛋白质样品与5X样品缓冲液(20ul+5ul)在一个eppendorf 管中混合。放入100℃加热5-10min，取上清点样。

2. 分离胶及浓缩胶的制备

① 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH₂O冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干;

② 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，按照Bio-Rad Mini Ⅱ/Ⅲ说明书提示装好玻璃板;

③ 按如下体积配制10%分离胶8.0 ml，混匀：ddH₂O 3.0 ml;1.0 mol/LTris-HCl pH 8.8 2.1 ml;30% Acr-Bis 2.8 ml;10% SDS 80 ul;10%AP 56 ul;TEMED 6 ul。

④ 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层ddH₂O ，大约20 min后胶即可聚合;

⑤ 按如下体积配制6%浓缩胶3.0 ml，混匀：ddH₂O 1.0 mol/LTris-HClpH 6.8 30% Acr-Bis;2.0 ml 400 ul 600 ul;10% SDS 10% AP TEMED;36ul 24ul 4ul。

⑥ 将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳;

⑦ 装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20 μl;

⑧ 稳压200V，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，时间约为45-60min。

⑨ 卸下胶板，将分离胶放入染色液中，常温染色1～2 h，然后加入脱色液，置于80 rpm脱色摇床上脱色，每20 min更换一次脱色液(10 ml 冰乙酸;45 ml乙醇;45 ml蒸馏水)至完全脱净。