技术应用介绍— 基础篇
对于目的蛋白的功能和结构的分析来说,得到纯度、浓度和均一性都比较满意的蛋白质是进一步研究的关键。目前对于蛋白纯化来说,又有哪些常用的方法和技术呢?今天我们从最简单的蛋白纯化技术分类开始聊起~
ÄKTA蛋白纯化原理
在蛋白质的氨基酸组成中,因为芳香族氨基酸侧链含有苯环共轭π键系统在近紫外区(200-400nm)有吸收光的能力。
蛋白质由于含有这些氨基酸,所以也有紫外吸收能力,一般最大吸收波长在280nm处。所以ÄTA蛋白纯化系统在纯化蛋白过程中主要监测280nm波长条件下紫外吸收光谱的变化,从而也方便测定样品中蛋白质的相对含量。
纯化层析技术分类
根据蛋白的特性,一般可以有以下5种纯化方法。
目前平台配备的主要是前四种层析纯化的各种凝胶柱。反相层析技术在一般的蛋白纯化中较少使用,下面将详细介绍常用的前四种层析技术原理及特点。
凝胶过滤层析
根据大小和形状分离,这种分离方式是非吸附性的,整个分离过程中只需要一种缓冲液,实验操作方便。
在峰谱图中,出峰顺序是:大分子先流出层析柱,小分子后出。
离子交换层析
不同蛋白质的等电点(pI,isoelectric point)特性,使在不同pH缓冲液条件下所带正/负净电荷不同,选择不同的离子交换柱实现分离。
离子交换层析属于吸附性分离方式,纯化过程中它具有可逆、操控性强及实现样品浓缩等特点。在精纯实验中是常与其它方法相结合使用的主要技术。
亲和层析
通过生物分子之间的特异性相互作用来实现分离的层析方法。
亲和层析具有高选择性、高纯度、快速、浓缩等特点,在重组蛋白的分离中多作为第一步的粗纯,实现对绝大部分杂质蛋白的去除。
疏水相互作用层析
依据生物分子间疏水性差别实现分离的一种层析方式。
高离子强度下,增进蛋白质中的疏水性氨基酸与层析介质间的疏水性相互作用,削弱其静电作用力。
洗脱时,降低流动相离子强度,削弱蛋白质分子与层析介质间的疏水作用,实现目的蛋白的纯化和收集。
疏水作用层析也属于吸附性分离方式,对具有疏水特性的目的蛋白具有高选择性和浓缩等特点。
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