NO调节蛋白质甲基化

iNature：甲基化以及NO基于的S-亚硝基化是非常保守的蛋白质翻译后修饰，可以调控不同的生物过程。在高等真核生物中，PRMT5催化精氨酸对称性的二甲基化作用，底物包括剪接体的成员。在拟南芥prmt5突变体里，出现了严重的发育缺陷以及胁迫应答的损害。以前一直很少知道PRMT5的活性是怎么调控的。这篇文章中，Hu等人发现在胁迫应答中NO正调控PRMT5的活性，那是通过Cys-125的亚硝基化作用。在prmt5-1的突变体中，PRMT5 C125S点突变的转基因，可以完全恢复发育表型，但是在胁迫应答及NO应答方面是不能被恢复的，而且，在 PRMT5 C125S /prmt5-1植株里面，盐诱导的精氨酸的二甲基化作用被消除了，这和pre-mRNA的异常剪切相关联。总的来说，胁迫诱导产生的NO传递到PRMT5上，进而调节蛋白质的甲基化作用。

真核生物细胞发育及胁迫应答过程会涉及产生活性氧及氮类化合物，包括自由基NO，这分子是可以作为短程或者是长程的信号分子。其中NO一个主要的信号转导机制是可逆的结合蛋白中的Cys，形成氧化还原敏感的S-nitrosothiol (SNO) 翻译后修饰。S-亚硝基化（S-nitrosylation）经常影响蛋白质的活性，定位，结构，相互作用模式。因此，NO被发现调控不同细胞的信号过程，基因表达。最近，S-亚硝基化作用同其他几种翻译后修饰相互作用，因此也丰富了细胞信号调控的内容（Skelly，2016）。

精氨酸甲基化是非常重要的一种蛋白质翻译后修饰，对于转录的表观调控，pre-mRNA的剪接，DNA损伤修复，mRNA翻译过程至关重要(Blanc and Richard, 2017; Liu et al., 2010)。精氨酸甲基化由一群蛋白质精氨酸甲基转移酶进行催化产生。 在植物里面，根据催化活性，可以分为二类 。类型I的可以产生不对称的二甲基精氨酸，类型II的可以产生对称的二甲基精氨酸 。PRMT5 是类型II的精氨酸甲基转移酶，可以与不同的底物相互作用以及甲基化底物，包括组蛋白及非组蛋白。在高等植物里面， PRMT5调节大量的生理学过程，包括开花时间，生长速率，叶子形态发育，生物钟以及胁迫应答 (Bedford and Clarke, 2009）。PRMT5突变引起多种生理表现及对NaCl超级敏感，这和pre-mRNA的异常剪切相关联。尽管PRMT5涉及调控大量的生物学过程，但是PRMT5自身怎么被调控还是不清楚。

正如上面所说的，S-亚硝基化与蛋白质精氨酸甲基化都涉及调控胁迫应答，这暗示了这俩种翻译后修饰可能存在着交流。

在谈正文之前，先说一下 生物素转化实验（biotin-switch assay）的实验原理（Jaffrey，2001）。在蛋白质中，Cys可以存在三种形式，自由的巯基，二硫键及亚硝基硫酯，首先用化学物质MMTS使本来存在的巯基转化为甲基硫硫酯，然后使用抗坏血酸钠盐 【ascorbate sodium (Asc）】还原亚硝基硫酯，使其成为游离的巯基，之后就是使用HPDP-生物素与经过处理过的蛋白质中的游离的巯基反应，偶连上生物素，最后通过亲和素来纯化蛋白，用相应的抗体检测就行了。

Fig.1 生物素转化实验

我们在2015年通过蛋白质组学的方法，鉴定到了PRMT5可以被S-亚硝基化（Hu，2015）。为了确认这一结果，通过在体内及体外都发现PRMT5被S-亚硝基化（Fig.2）

Fig.2 PRMT5被S-亚硝基化

通过体内的质谱学实验可知，PRMT5有3个位点可以被S-亚硝基化。由于C125很保守，故我们只是研究这个位点。在体内及体外把PRMT5 的125位氨基酸C转变成S，相比于正常的PRMT5，生物素转化实验的强度降低了25%（Fig.3）。以上结果说明，PRMT5的C-125可以被亚硝基化。

Fig.3 PRMT5的C125被S-亚硝基化

PRMT5的C-125被S-亚硝基化后，对其生物活性有什么影响了，通过体外的生化实验可知，可以明显的增加其精氨酸甲基化转移酶的活性（Fig.4）,PRMT5作用的底物是H4，同理，myelin basic protein (MBP)及LSM4也出现类似的结果。

Fig.4 S-亚硝基化PRMT5，增强酶活性

现在想知道，PRMT5的C-125位点的S-亚硝基化在体内是否有生物学功能？通过PRMT5 C125S的转基因分析，它可以恢复prmt5突变体的发育缺陷。但是不能恢复对于胁迫应答的恢复（Fig.5）。相比于野生型的转基因，PRMT5 C125S的转基因组蛋白H4及剪接体一些成分的二甲基化修饰明显的下降，导致相关基因的失调控。

Fig.5 PRMT5 C125S转基因不能恢复胁迫应答过程

实际情况下，胁迫环境或者是gsnor1-3突变体里，可以增加NO的产生（Fig.6）。而NO的增加又可以使PRMT5的S-亚硝基化作用增强，之后就会促进其精氨酸甲基转移酶的活性，导致其底物的二甲基化，进而调节其功能。

Fig.6 胁迫可以增加NO的产生

很有趣，在盐胁迫环境下，GSNO不敏感的现象被完整的PRMT5所互补，而不是PRMT5 C125S转基因（Fig.7），另外ABA也呈现了类似的现象。这些结果表明，GSNO诱导的 PRMT5  Cys-125的S-亚硝基化正调控胁迫应答（盐，ABA）。

Fig.7 在胁迫下，PRMT5对于NO应答由 C125决定

总的来说,NO可以调控PRMT5甲基化酶的活性，进而产生相应的生物学功能。一般而言，蛋白被S-亚硝基化，会抑制其功能。但在这篇文章中，为什么PRMT5的C125 S-亚硝基化反而增加其酶的活性，这很耐人寻味？另外，为什么是PRMT5C125S就能恢复prmt5突变体的生理缺陷，而不能恢复胁迫应答作用？还有，PRMT5的S-亚硝基化可以存在于3个位点，其他俩个位点S-亚硝基化又有什么功能？这些都是值得探索。

话外篇

 左建儒研究组与曹晓风研究组、鲍时来研究组、孔照胜研究组合作研究，发现了在植物应答胁迫的过程中，一氧化氮调控蛋白质甲基化研究的新机制，相关论文于2017年8月17日在Molecular Cell杂志发表(网络版于7月27日发表)，并被该刊选为当期“Featured Article”，配发了题为“Modulating the Modulator: Regulation of Protein Methylation by Nitric Oxide”的专文评述。Molecular Cell杂志每期推选一篇“Featured Article”，并书面采访第一作者，旨在鼓励和褒奖青年科学家（Fig.8及9）。

Fig.8 该文章当选为Featured Article

Fig.9 Molecular cell 对第一作者的采访

 Steven H. Spoel对本文进行了专门的评述：PRMT5涉及调控可变剪切，NO可能通过在胁迫条件下，通过PRMT5 S-亚硝基化 介导功能性的转录本调控以及产生新的可变剪接体。除了翻译后修饰的调控作用，NO同另外一些修饰交流进而影响蛋白质功能变化（Fig.10）。

Fig.10 Spoel对本文的评述

Spoel教授现在主要对生物体怎么应答环境的变化很感兴趣，而且Spoel教授也是个多产的学者，Spoel在Nature，Cell，Science，Plant Cell，PNAS 等顶尖杂志发表了上百篇文章，其领导的实验室在生物对于环境应答机制等方面的研究硕果累累，在国际上享有盛誉。

通讯作者简介

Fig.11 左建儒教授

左建儒，研究员，博士生导师，课题组长。1984年7月毕业于西南师范大学生物系，获学士学位。。1994年12月获美国迈阿密大学博士学位，1995年进入美国洛克菲勒大学进行博士后研究。2000年入选中国科学院“百人计划”，并在结题验收中获得优秀。2001年国家杰出青年科学基金获得者。2003年入选国家自然科学基金委员会“优秀创新群体”。中国遗传学会常务理事、植物遗传与基因组学专业委员会主任。 Molecular Plant, Physiologia Plantarum, Plant Signaling & Behavior, Biology of Cell, 《科学通报》，《生物化学与生物物理进展》等刊物编委 。北京大学、山东农业大学、兰州大学和江苏大学客座教授。

信息来源：http://zuolab.genetics.ac.cn/team/

参考文献

Skelly, M.J., Frungillo, L., and Spoel, S.H. (2016). Curr. Opin. Plant Biol. 33, 126–132.

Blanc, R.S., and Richard, S. (2017). Arginine Methylation: The Coming of Age.

Mol. Cell 65, 8–24.

Liu, C., Lu, F., Cui, X., and Cao, X. (2010). Histone methylation in higher plants.Annu. Rev. Plant Biol. 61, 395–420.

Bedford, M.T., and Clarke, S.G. (2009). Protein arginine methylation in mam-

mals: who, what, and why. Mol. Cell 33, 1–13.

Jaffrey, S.R., and Snyder, S.H. (2001). The biotin switch method for the detec-

tion of S-nitrosylated proteins. Sci. STKE 2001, pl1.

Hu, J., Huang, X., Chen, L., Sun, X., Lu, C., Zhang, L., Wang, Y., and Zuo, J.

(2015). Site-specific nitrosoproteomic identification of endogenously S-nitro-

sylated proteins in Arabidopsis. Plant Physiol. 167, 1731–1746.