摘 要 桑叶为桑科落叶乔木桑树Morus alba L.的叶始载于《神农本草经》 药用历史悠久。近年的研究成果证实桑叶、桑白皮萃取物能通过抑制酪氨酸酶活性有效减少黑色素生成桑树因此备受美白产品的青睐。民间有人通过饮用桑树叶煎煮的汤剂和把新鲜桑叶捣碎敷脸来治疗色斑和青春痘但是把桑叶萃取精华添制于护肤品中则更为有效、安全和方便。虽然桑叶的美白成分及美白机理尚不清楚但随着桑叶研究的不断深入桑叶有望成为美容美白化妆品的重要原料。 本课题主要研究了不同月份桑叶乙醇提取物及分离各部位的酪氨酸酶抑制活性抗氧化和清除 DPPH·活性总黄酮含量与酪氨酸酶抑制性的关系。对筛选出的洗脱有效部位进行成分的初步分析和化妆品急性安全性评价为桑叶美白化妆品的开发提供参考。 1. 本课题中桑叶粗提物用 50%乙醇作提取溶剂分离洗脱有效部位用水-乙醇梯度洗脱浓缩、冻干后保存备用。通过对 40 种天然中草药进行酪氨酸酶抑制活性测定得出抑制活性较高的原料为桑叶和桑白皮并确定以桑叶为进一步研究材料。 2.考察不同采摘期桑叶的酪氨酸酶抑制性并用 NaNO2-Al(NO3)3显色法测定各提取物的总黄酮含量结果表明桑叶酪氨酸酶抑制活性与总黄酮的含量可能存在正相关其中以 11 月份桑叶提取物的总黄酮含量最高 27.71 mg/g酪氨酸酶抑制率也最大 78.48%同时对 11 月份提取物分离的各部位进行总黄酮含量测定结果显示酪氨酸酶抑制活性最高的为 50%乙醇洗脱部位抑制率为 95.09%总黄酮含量为 30.86 mg/g但其总黄酮含量低于活性较高的 25%乙醇洗脱部位抑制率为 78.44%总黄酮含量为 34.96 mg/g。综合以上结果可作如下推测即酪氨酸酶的抑制活性不仅与总黄酮含量有关而且与其成分的类别有关极性大的黄酮苷的酪氨酸酶抑制活性小于黄酮苷元这与相关文献研究结果相一致。 3. HPLC 法对 50%乙醇洗脱部位进行成分初步分析测得该洗脱有效部位存在芦丁和槲皮素两种活性物质但含量有差别。芦丁含量甚少不具有统计学意义作忽略处理槲皮素含量较高经计算该洗脱有效部位中槲皮素的平均含量为 2.46%RSD 为 2.9%。HPLC 方法精密度高重复性良好结果真实可靠。 4. 分别以总抗氧化试剂盒和清除 DPPH·法考察不同样品及各部位的抗氧化性和清除自由基活性总体而言抗氧化性越好清除自由基能力越强。 扬州大学硕士学位论文 2 5. 本课题拟以桑叶提取物为原料为开发相应的化妆品提供依据。选做了化妆品安全性评价的三项基本试验即急性经口毒试验、 急性皮肤毒/皮肤腐蚀试验和急性眼刺激试验初步评价结果表明本论文提取工艺所得的桑叶提取物为无毒、无刺激、安全性良好的化妆品原料。
1 桑叶的概述 1.1 桑叶的研究现状 桑叶始载于《神农本草经》药用历史悠久。桑叶为桑科落叶乔木桑树Morus alba L.桑叶味苦、性寒、有散风去热、清肝明目等功效主要用于外感风热所致的发热、头昏头痛、咳嗽、咽喉肿痛等症还用于肝经实热或风热所致的目赤、涩痛、多泪等症。长期以来桑叶一直作为养蚕的主要饲料此外桑叶也是一种很好的中药。作为国家卫生部批准的药食两用原料安全性好、无副作用应用广泛。民间已有用桑树煎煮的汤剂和把新鲜桑叶捣碎敷脸来治疗色斑和青春痘且效果显著。近年来对桑叶的药理研究主要集中于对其降血脂、降血糖、降血压等作用方面对其抗氧化、抗衰老、美白等作用方面的研究较少。据文献报道桑叶的乙醇提取物对酪氨酸酶活性有一定的抑制作用。 桑叶含有 N-甲基-1-脱氧野尻霉素N-Me-DNJ 、2-氧-α-D-半乳糖吡喃糖苷-1-DNJGAL-DNJ 、Fagomine 等降血糖活成分具有显著的降血糖作用且毒性小服用安全作为抗糖尿病新药开发用具有广阔前景。广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所从桑叶中提取降糖有效成分并将其开发成防治糖尿病的新产品—桑宁茶药理和临床试验证明其降糖效果明显已获得发明专利授权。 日本曾兴起一股食用桑叶的热潮在我国也因其风味独特、绿色无害、天然保健等特点受到人们的喜爱。目前利用桑叶研制的食品很多包括普通食品、保健食品、饮料、调味品等己开发的产品如桑叶茶、桑叶汁饮料、桑叶酒、桑叶醋、桑叶酱等。桑叶作为食品、药品、化妆品等的重要原料对其有效成分进行萃取纯化、分析和应用是今后发展的重点。 1.2 桑叶的化学成分及药理作用 桑叶营养丰富含有人体所需的 17 种氨基酸7 种维生素还含有锌锰钙铁等营养元素具有药性平和无毒副作用等特点。作为调节生理、维护健康、增强体质的食品越来越受人们的欢迎特别适合糖尿病和高血压患者。国家卫生部 1991 年第 45 号文公布批准桑叶既是食品又是药品。近年来人们对桑叶的化学成分药理作用方面进行了较深入的研究研究表明桑叶的萃取物对祛斑和治疗青春痘均有较好的疗效有很好的美容效果还具有降血糖、降血脂、抗炎、抗衰老、清除氧自由基、抗肿瘤等作用。 1.2.1 化学成分 扬州大学硕士学位论文 6 桑叶含有丰富的黄酮类化合物 约占桑叶干重的 1%~3%是所有植物茎叶中含量较高的一种。此外还含有甾体及三萜类化合物、香豆素、挥发油、生物碱、氨基酸、有机酸、维生物等成分。桑叶中食用纤维含量达 14.5%超过蔬菜和水果。 1.2.2 桑叶的药理作用 1.2.2.1 降血糖作用 近年来国内外学者对桑叶的降血糖活性成分进行了深入研究。研究表明生物碱和多糖类成分是桑叶中主要的降血糖活性成分。 Asano 等[10]比较了从桑叶中分离到的七种生物碱的降血糖活性发现多羟基去甲莨菪碱 Calystegine B2具有很强的糖苷酶 α-葡萄糖苷酶和β-半乳糖苷酶抑制作用。 Kimura研究了除 Calystegine B2以外的六种生物碱对由链脲菌素streptozocinSTZ引起的糖尿病小鼠的降糖作用结果表明N-Me-DNJ、GAL-DNJ、Fagomine 都可显著的降低血糖水平其中 GAL-DNJ 和 Fagomine 降血糖作用较强。 方晓等研究了桑叶浸出液对糖尿病大鼠的降血糖作用试验发现其对实验性糖尿病大鼠有显著的降血糖作用初步认为降血糖的活性成分为生物碱。 日本学者利用自然发病且症状类似成人型糖尿病和糖尿病合并症的大白鼠进行研究给糖尿病大白鼠喂饲含 2.5%和 5%桑叶的饲料证实桑叶具有抑制血糖升高和提高葡萄糖耐受量的作用。进一步研究发现主要作用的成分是 1-脱氧野尻霉素1-DNJC6H13NO4 分子量 163.17该化合物能与小肠中的麦芽糖酶、蔗糖酶和乳糖酶等α-糖苷酶结合且结合亲和性大于麦芽糖、蔗糖和乳糖。1-DNJ 与上述酶结合使双糖不能进一步分解为单糖导致双糖无法被吸收从而明显抑制了食后血糖急剧升高的现象耐糖量试验GTT亦表明桑叶能抑制胰腺兰格尔罕氏岛的病变进展同时可维持胰岛素的分泌抑制血糖值的升高延缓糖尿病的发作和恶化此类效应与 DNJ 呈明显的剂量依赖性。 桑叶多糖、 生物碱及产品中其他成分有一定的协同配伍作用。 Ito 等将类黄酮与 DNJ结合或者与桑叶中的 DNJ 结合并将其加入到饮料中这种饮料比单独的 DNJ 或者是桑叶中所含的 DNJ 更能有效抑制血糖的上升。 1.2.2.2 抗炎作用 陈福君等研究了桑叶的抗炎作用发现桑叶对巴豆油所致小鼠耳廓肿胀、醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增加、角叉菜胶所致的小鼠足趾浮肿等具有明显的抑制作用表明桑叶具有较强的抗炎作用与祛风、清热功效相符。实验证明桑叶清热解毒的功效对桑叶酪氨酸酶抑制性成分的研究及应用 7治疗青春痘具有良好的效果。 1.2.2.3 抗衰老作用 通常在老年斑和褐色斑及雀斑形成时可发现过氧化脂质在皮肤内大量蓄积而增加。浙江医科大学临床药理研究所科研小组经过 4 年的测试和临床跟踪得出桑叶具有类似人参的补益与抗衰老、稳定神经系统功能等作用能缓解生理变化引起的情绪激动提高体内及皮肤表皮细胞内超氧化物歧化酶活性加强活性氧自由基消除阻止体内有害物质产生改善机体代谢减少或消除已经产生并积滞于体内的脂褐质。 1.2.2.4 清除氧自由基的作用 自由基是体内重要的致病因子与多种疾病的发生有关。过量的自由基能破坏皮肤的正常生理功能加速皮肤老化使色素沉着增多或加深。黄代青等用发光法进行研究发现桑叶提取液对体外氧自由基系统、黄嘌呤-嘌呤氧化酶体系产生的超氧阴离子、Fenton体系产生的羟自由基和过硫酸胺 N,N,N′N′-四甲基乙二胺体系产生的氧自由基均有较强的清除作用。同时还研究了高浓度提取液对果蝇寿命的影响结果表明桑叶提取液对上述系统产生的氧自由基和羟自由基具有相当强的清除作用在剂量比《中医大辞典》规定的大 3 倍以上时并不降低雌雄果蝇的平均寿命且对雌雄果蝇的最高寿命均有一定的提高。Kim 等报道从桑叶中分离到的类黄酮具有显著的清除自由基作用。 1.2.2.5 抑制酪氨酶活性作用 桑树提取物是由法国人开发出来的最新的美白成分其作用温和有效、自然美白。近年的研究成果证实从桑叶、桑白皮萃取的有效成分能抑制酪氨酸酶的活性有效减少黑色素生成桑树因此备受美白产品的青睐。民间有人通过饮用桑树叶煎煮的汤剂和把新鲜桑叶捣碎敷脸来治疗色斑和青春痘但将桑叶萃取精华添制于护肤品中则更为有效、安全和方便。桑叶富含黄酮类、酚类、氨基酸、有机酸、胡萝卜素、维生素及多种人体所需的微量元素等这些活性物质协同作用对皮肤有营养、保湿及修复作用可以增加弹性、消除色素沉着、防止皮肤粗糙。虽然桑叶的美白成分及美白机理尚未明确但随着桑叶研究的不断深入桑叶将成为美容美白化妆品的重要原料之。 1.3 我国的桑叶资源情况 桑叶又名“铁扇子” 属于桑科桑属植物桑树(Morus alba L.)的叶。桑原产于中国和朝鲜全球约有 16 种分布于北温带、亚洲热带和非洲热带及美洲地区我国约有 11 种分布于全国大部分地区以长江流域尤其江浙一带为多在我国己有 4000 多年的栽培 扬州大学硕士学位论文 8 历史现有近千万亩桑园是世界上最大的桑树种植国。桑树桑树生长快适应性强宜植区广对土质要求不高不占耕地耐剪伐产叶量高。桑叶是桑树的主要产物约占地上部产量的 64%每年可摘 3-6 次生命力很强。 桑叶在我国有着极大的资源优势。2005 3000 斤/年保守估计2005 年我国鲜桑叶将达到 351.3 亿斤。我国国家卫生部于 1991 年公布桑叶为药食两用品目前除养蚕外桑叶并未被充分利用出现了大量桑叶过剩的现象浪费了大量宝贵资源。因此有必要对桑叶丰富的营养成分和生物活性成分进行深入研究寻找桑叶的多用途开发渠道改善传统的桑叶利用结构既可以充分利用自然和土地资源又可以提高桑叶的利用价值。 1.4 桑叶美白活性研究进展 近年来天然成分的皮肤美白剂的应用成为人们关注的焦点。酪氨酸酶即多酚氧化酶是黑色素生物合成中将酪氨酸转变为多巴醌的关键酶。酪氨酸酶所催化的这一过程决定了动物肤色同样也涉及局部色素过多沉着如黑色素瘤、雀斑、黄褐斑等。酪氨酸酶抑制剂在改善肤色阻止黑色素过多产生过程中有重要作用大量的天然酪氨酸酶抑制剂已见报道。 1996 年韩国学者发表了对近 300 种植物萃取物对酪氨酸酶的抑制作用的研究 证实了桑叶的有效性。 其中桑叶和桑白皮的提取物呈现出较高的多巴氧化和酪氨酸酶抑制性。 自由基引起的氧胁迫可诱发色素沉着桑叶或桑白皮的提取物有清除自由基和抗氧化的活性有利于脱除色素。体外研究表明干桑叶 85%甲醇提取物可抑制黑素生物合成途径中多巴向多巴醌的转变。 从桑叶中分离的Mulberroside F moracin M-6,3'-di-O-β-D- glucopyranoside抑制酪氨酸酶活性和人黑色素瘤细胞黑色素的生成提示该物质可应用于皮肤美白但还需进一步的安全性研究。 国内学者对桑树树皮水提取物用不同规格的微孔滤膜进行过滤对相应的渗透物和渗余物进行活性研究结果表明渗透物中保留酚类物质浓度较高的部分呈现出较好的抗氧化能力如自由基的清除作用、还原力及总抗氧化活力和较强的酪氨酸酶抑制性。0.45 �0�8m微孔滤膜滤过的组分此类活性物质含量最高抗氧化性和美白能力也最强。 浙江大学临床药理研究所通过 4 年的实验证实桑叶具有类似人参的补益和抗衰老作用。人参属于热补而桑叶属于清补无忌限无论老幼均可使用且四季皆宜桑叶无中枢神经系统安定作用对免疫力无影响无促进增长及激素样作用对老年性疾病有较大的应用价值。 徐丽桑叶酪氨酸酶抑制性成分的研究及应用 9桑黄素是一种可从桑叶、蜂胶中提取的天然活性物质有研究表明桑黄素能较高效抑制酪氨酸酶活性抑制活性大小为曲酸>桑黄素>熊果苷而且桑黄素具有较强的抗氧化性为以桑黄素为抗氧化剂和增白剂的特效化妆品开发提供了理论依据。 王芳从桑叶 70%乙醇提取物中经分离、 结构鉴定得到 5 种黄酮单体芦丁Rutin、异槲皮苷 Isoquercitrin、 紫云英苷 Astragalin、 桑色素 Morin和山奈酚 Kaempferol 。并研究各黄酮单体及总黄酮对酪氨酸酶抑制作用结果表明桑叶总黄酮类化合物对酪氨酸酶的抑制作用明显强于各黄酮单体且呈显著性差异而且桑叶总黄酮对酪氨酸酶的抑制率与阳性对照之间无显著差异说明桑叶黄酮对酪氨酸酶的影响存在各单体间的协同配伍作用。 美国加州 Berkeley 大学的 Kubo 教授对酪氨酸酶抑制剂的研究最为前沿大量研究表明很多从天然植物中提取到的酪氨酸酶抑制剂其主要成分均为黄酮类物质。 2 立题依据和意义 天然产物化妆品安全高效特别是添加中草药活性成分的化妆品越来越受到消费者的青睐。在国际上化妆品发展最有代表性的美国、日本、法国和德国等国家中中草药因其天然药效温和副作用小被广泛认同。从日本化妆品工业的发展趋势看各化妆品公司使用的中草药已达 200 余种。目前日本含天然中草药的化妆品已占整个化妆品市场的 50%以上。因此寻找和开发高效、且对人体无副作用或副作用小的天然中草药美白祛斑产品已成为化妆品领域的研究热点。 酪氨酸酶抑制率是评价美白剂美白效果的重要指标一般来说抑制率越高美白效果越好。酪氨酸酶作为黑色素合成的关键酶其异常过量表达可导致人体的色素沉着性疾病在果蔬中也是导致褐变的主要酶类。 目前国内外用于化妆品的美白剂主要为氢醌、曲酸、果酸、熊果苷和 VC 衍生物等但由于现有的美白剂或多或少存在细胞毒性强、皮肤渗透性弱以及稳定性差或价格昂贵等缺点使它们的应用受到限制。 将桑叶应用于化妆品行业不仅大幅度提高了桑叶的自身价值还可改善传统的桑叶利用结构充分利用了自然和土地资源。目前市售的以桑叶为原料的化妆品多为日韩开发均为一线品牌价格昂贵国内以桑叶为原料的化妆品又过于低端且尚未形成规模只是简单加工再和其他生药按一定配比即出售。 因此要想推广桑叶在国内化妆品的市场必需对桑叶进行深入研究也只有将桑叶提取物的高洗脱有效部位即精华部分作为美白祛斑的添加剂才能更好的突出其效果赢得消费者的青睐。 扬州大学硕士学位论文 10 本课题组通过对 40 多味中药白茯苓六月雪葡萄籽地榆辛夷连翘白鲜皮桑白皮桃仁天麻葛根白芨沙苑子土茯苓甘草当归蛇床子龙胆草地骨皮败酱草火棘川芎白芍猪苓楮实子木瓜防风蒲公英玉竹白芷银杏叶银杏茵陈白术金银花苦瓜菟丝子白蒺藜白僵蚕桔梗桑叶乙醇提取物的酪氨酸酶活性研究的结果表明，桑白皮和秋季桑叶的酪氨酸酶抑制性最强，桑白皮的抑制性稍高于桑叶。但考虑到原料的取材及生长周期等因素，以桑叶为开发原料更合理也更具有实际意义。 基于上述理论和实际情况本课题以桑叶乙醇提取物为研究对象，以 D-101 大孔树脂为填料水、乙醇梯度洗脱分离得各部位以不同部位酪氨酸酶抑制性为指标筛选桑叶有效部位，并对有效部位进行成分初步分析和安全性评价。同时为了综合评价桑叶的美白功效，还研究了各部位相应的抗氧化活性和清除自由基活性。 3 主要研究内容 1. 桑叶乙醇提取物的制备及有效部位的分离及黄酮含量测定。 2. 粗提物及有效部位的活性测定酪氨酸酶抑制性、抗氧化性和清除自由基活性。 3. 有效部位的成分初步分析。 4. 有效部位的安全性评价。 4 实验流程 桑叶原料活性检测 有效部位安全性评价 有效成分标准品HPLC法主要成分高效低毒部位化妆品添加剂粗提物冻干粉60%乙醇浸提急性皮肤毒试验眼刺激试验水洗10%醇洗25%醇洗50%醇洗75%醇洗95%醇洗部位1部位2部位3部位4部位5部位6活性检测D101 大孔树脂有效成分分析急性经口毒试验 图 1-1 实验流程图 Fig. 1-1 Experimental flow chart 桑叶酪氨酸酶抑制性成分的研究及应用 11桑叶是一种传统的中药应用广泛。目前对桑叶的研究主要集中在降血糖、降血脂的药品和保健品的开发，近年来在化妆品方面的应用也越来越多。据文献报道和初步测定，桑叶的酪氨酸酶抑制性很强，桑叶粗提物在细胞培养和临床表皮实验中都表现出酪氨酸酶抑制及抗氧化活性，确实具有降低黑色素含量的功能且不会造成皮肤刺激、红肿等不适情形进一步证实桑叶为安全的天然原料尤其在美白化妆品方面有很大的开发潜力。然而其主要洗脱有效部位和成分研究的较少尚不够透彻。因此，有必要对相关的活性成分进行更进一步的研究。以利于更加科学的利用桑叶这一来源广泛、廉价易得的传统作物为规模化生产提供保障。
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