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Bradford法测蛋白质浓度

大智汇小科研 2019-02-05 18:42:56


一、实验目的

配制一组浓度分别为0.10mg/ml ,0.08mg/ml,0.06mg/ml ,0.04mg/ml ,0.02mg/ml,0 mg/ml的牛血清蛋白(BSA)溶液,测定这组溶液的吸光度,得到蛋白质浓度对吸光度的一条标准曲线。测定未知蛋白质浓度样品的吸光度,根据标准曲线得到蛋白质的浓度。

二、实验原理

考马斯亮蓝(CBB)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质—色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1 000μg/ml,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

三、实验过程

1.准备所需的药品和仪器。

2.计算所需配制的溶液的量。

先配制1 mg/ml的牛血清蛋白(BSA)母液,再往母液中加入磷酸缓冲溶液(PBS )配制一组浓度分别为1.0mg/ml ,0.8mg/ml,0.6mg/ml ,0.4mg/ml ,0.2mg/ml的BSA溶液,再将这组溶液稀释10倍,得到一组浓度分别为0.10mg/ml ,0.08mg/ml,0.06mg/ml ,0.04mg/ml ,0.02mg/ml的BSA溶液。计算第一步稀释各组需要的BSA溶液及PBS溶液的体积。

3.具体操作过程。

  • 用天平称量1.00g牛血清蛋白(BSA ),溶于去离子水中,配成100ml的溶液,溶液的浓度为10mg/ml。用移液枪分别取100ul,80ul,60ul,40ul,20ul的BSA溶液,置于1.5ml的EP管中,再分别加入900ul,920ul,940ul,960ul,980ul的磷酸缓冲溶液(PBS)配成1ml的溶液,震荡使溶液混合均匀。得到一组浓度分别为1.0mg/ml ,0.8mg/ml,0.6mg/ml ,0.4mg/ml ,0.2mg/ml的BSA溶液。

  • 移液枪分别移取100ul刚配好的一组BSA溶液,置于1.5ml的EP管中,各加入900ul的PBS溶液,震荡使溶液混合均匀。得到一组浓度分别为0.10 mg/ml ,0.08mg/ml,0.06mg/ml ,0.04mg/ml ,0.02mg/ml的BSA溶液。另外量取1ml的PBS溶液(BSA溶液浓度为0 mg/ml)作对照试验。

  • 用移液枪分别移取50ul配好的一组BSA溶液,滴加到孔板中,再分别加入200ul的考马斯亮蓝(CBB)。静置10min后,用酶标仪测得这组BSA溶液的吸光度。

    四、实验数据及处理

  • 测得的BSA溶液的吸光度如下:

  • 用orgin作出吸光度对BSA浓度的关系曲线。

    五、实验结果分析

    得到的吸光度对BSA浓度的关系曲线为y=3.09x+0.6807,R2=0.9541。可以看出吸光度—浓度的关系曲线中R2值较小,即测得的吸光度与浓度的线性不是很好。究其原因可能有以下两点:一是移液枪的操作不是很熟练,二是移液枪在移液过程中存在着气泡,使移的液体体积不准确。





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