双缩脲法测定蛋白质含量
2023-05-18 23:00:13
一、目的
掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。
二、原理
具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量氨基酸成分无关，因此可用比色法测定蛋白质含量。在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540~560nm下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知的蛋白质浓度。
三、操作方法
1、制作标准曲线
取6支干试管分成两组，按下表操作：
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
5mg/ml标准蛋白液（ml） | 0.0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
蒸馏水（ml） | 1.0 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0.0 |
双缩脲试剂（ml） | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 |
蛋白浓度(mg/ml) | 0.0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
充分混匀后，室温下（20~25℃）放置30min | ||||||
A540 | ||||||
取两组测定的A540值的平均值，即A540为横坐标，蛋白质浓度为纵坐标，绘制标准曲线，或求回归方程（每班有两组做标准曲线）。
2、样品测定
称取100~200mg样品于三角瓶中，向瓶中加入5ml的0.05M的NaOH和20ml的双缩脲试剂，振荡15秒，静置30分，过滤后滤液加入比色皿，测定A540。
四、结果与分析
取两组测定的平均值计算：
根据标准曲线，由A540计算出所测样品中的蛋白含量。
其中，Y为标准曲线查得蛋白质得浓度（mg/ml），N为总体积（25ml），c为样品重量，r 为酪蛋白纯度（86%）。
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