提蛋白 & 蛋白含量的测定

提蛋白 & 蛋白含量的测定

一、单层贴壁细胞总蛋白的提取：

1. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿，使残余培养液流到瓶底，然后再用移液器将其吸走）

2. 每瓶细胞加3ml   4°C预冷的PBS(0.01M    Ph7.2~7.3)。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃取洗液。重复以上操作一次，共洗细胞两次以洗去培养液。将PBS弃尽后把培养瓶置于冰上。

3. 按1ml裂解液加10ulPMSF(100mM)，摇匀置于冰上。（注：PMSF要摇匀至无结晶时才可以和裂解液混合。）

4. 每瓶细胞加400ul含 PMSF的裂解液，至于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动。

5. 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（注：整个操作尽量在冰上进行）

6. 于4°C下12000rpm离心5min。(注：提前开离心机预冷)

7. 将离心后的上清分装转移到1.5ml的离心管中放于—20°C保存。

   
   

二、蛋白含量的测定

BCA法:Bicinchoninicacid法,是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu+。BCA与Cu+结合形成稳定的蓝紫色复合物，在562nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的紫蓝色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。

工作溶液（WR）配置：将50体积的BCA Reagent 与1 体积的Cu Reagent混合即为WR工作试剂，呈嫩绿色；室温1周内稳定。

标准蛋白溶液配置：用双蒸水、0.9%生理盐水、PBS或与待测蛋白样品匹配的缓冲液进行倍比稀释：20ul  4000ug/ml BSA +30ul稀释溶液（H20/PBS/0.9%NaCl）=50ul(BSA=1600ug/ml),从中取25ul连续倍比稀释，得到BSA标准溶液 1600、800、400、200、100、50、25ug/ml，各25ul。通常，样品蛋白浓度不会太高，也可以预先稀释待测样品，可以省略1600ug/ml标准管而直接从800或1000ug/ml开始，能节省标准蛋白用量。

    1.标准测定：将0.05~0.1ml标准品或待测样本与1ml WR工作液混合。 

      微板测定：将25ul标准品或待测样本与200ul WR工作液混合。

 2.37°C反应30min ;也可25°C室温2小时或过夜。60°C 30min反应可增加检测     灵敏度至5-250ug/ml。

 3.将反应管冷却至室温。测定562nm(可在540-590nm之间)光密度（OD）         值。

4.绘制标准曲线。X轴为BSA标准蛋白浓度（mg/ml或ug/ml）,Y轴为各标准管    对应的OD562值。用Excel拟合曲线并计算蛋白浓度。

标准测定和微板测定方案的加样量和比例

		微板测定方案		标准比色杯测定方案
标号	蛋白浓度(ug/ml)	标准或待测蛋白体积(ul)	WR工作试剂（ul）	标准或待测蛋白体积（ml）	WR工作试剂（ml）
1	0	25	200	0.05-0.1	1
2	25	25	200	0.05-0.1	1
3	50	25	200	0.05-0.1	1
4	100	25	200	0.05-0.1	1
5	200	25	200	0.05-0.1	1
6	400	25	200	0.05-0.1	1
7	800	25	200	0.05-0.1	1
8	1600	25	200	0.05-0.1	1
待测样品		25	200	0.05-0.1	1