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提蛋白 & 蛋白含量的测定

银河系科研汪 2019-05-07 19:41:31

提蛋白 & 蛋白含量的测定

一、单层贴壁细胞总蛋白的提取:

  1. 倒掉培养液,并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置一会儿,使残余培养液流到瓶底,然后再用移液器将其吸走)

  2. 每瓶细胞加3ml   4°C预冷的PBS(0.01M    Ph7.2~7.3)。平放轻轻摇动1min洗涤细胞,然后弃取洗液。重复以上操作一次,共洗细胞两次以洗去培养液。将PBS弃尽后把培养瓶置于冰上。

  3. 1ml裂解液加10ulPMSF(100mM),摇匀置于冰上。(PMSF要摇匀至无结晶时才可以和裂解液混合。)

  4. 每瓶细胞加400ul PMSF的裂解液,至于冰上裂解30min,为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动。

  5. 裂解完后,用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快),然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。(:整个操作尽量在冰上进行)

  6. 4°C12000rpm离心5min(:提前开离心机预冷)

  7. 将离心后的上清分装转移到1.5ml的离心管中放于—20°C保存。


二、蛋白含量的测定

BCA:Bicinchoninicacid,是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowery法蛋白定量相似,即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu+BCACu+结合形成稳定的蓝紫色复合物,在562nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比,据此可测定蛋白质浓度。与Lowery法相比,BCA蛋白测定方法灵敏度高,操作简单,试剂及其形成的紫蓝色复合物稳定性俱佳,并且受干扰物质影响小。与Bradford法相比,BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。

工作溶液(WR)配置:将50体积的BCA Reagent 1 体积的Cu Reagent混合即为WR工作试剂,呈嫩绿色;室温1周内稳定。

标准蛋白溶液配置:用双蒸水、0.9%生理盐水、PBS或与待测蛋白样品匹配的缓冲液进行倍比稀释:20ul  4000ug/ml BSA +30ul稀释溶液(H20/PBS/0.9%NaCl=50ul(BSA=1600ug/ml),从中取25ul连续倍比稀释,得到BSA标准溶液 16008004002001005025ug/ml,各25ul。通常,样品蛋白浓度不会太高,也可以预先稀释待测样品,可以省略1600ug/ml标准管而直接从8001000ug/ml开始,能节省标准蛋白用量。

    1.标准测定:将0.05~0.1ml标准品或待测样本与1ml WR工作液混合。 

      微板测定:将25ul标准品或待测样本与200ul WR工作液混合。

 2.37°C反应30min ;也可25°C室温2小时或过夜。60°C 30min反应可增加检测     灵敏度至5-250ug/ml

 3.将反应管冷却至室温。测定562nm(可在540-590nm之间)光密度(OD)         值。

4.绘制标准曲线。X轴为BSA标准蛋白浓度(mg/mlug/ml,Y轴为各标准管    对应的OD562值。用Excel拟合曲线并计算蛋白浓度。

标准测定和微板测定方案的加样量和比例


微板测定方案

标准比色杯测定方案

标号

蛋白浓度(ug/ml)

 

标准或待测蛋白体积(ul)

WR工作试剂(ul

标准或待测蛋白体积(ml

WR工作试剂(ml

1

0

25

200

0.05-0.1

1

2

25

25

200

0.05-0.1

1

3

50

25

200

0.05-0.1

1

4

100

25

200

0.05-0.1

1

5

200

25

200

0.05-0.1

1

6

400

25

200

0.05-0.1

1

7

800

25

200

0.05-0.1

1

8

1600

25

200

0.05-0.1

1

待测样品

25

200

0.05-0.1

1