钙蛋白酶抑制蛋白在神经系统疾病中的研究进展

CAST是CAPN内源性和特异性的抑制蛋白，抑制μ–Calpain和m–Calpain的活性。CAST对热稳定，较易纯化。CAST存在于各种组织的细胞质和细胞膜中，对调控CAPN的活性有重要意义，可以识别CAPN与Ca^2＋结合引起的构象变化并与之特异结合，起负向调控作用^[1,2]。

不同哺乳动物的CAST cDNAs片段在N末端编码区具有显著差别，分为四种类型。鼠和牛的CAST(分别是Type Ⅰ和Type Ⅱ) N末端与兔、猪及人(Type Ⅲ)相比具有较长的L区序列，Type Ⅳ是Ⅱ区一个不同的N末端序列。Type Ⅰ和Type Ⅲ mRNA在肝脏中表达较低，Type Ⅱ mRNA在心脏和骨骼肌中表达水平较高，而在肝脏、脑和中表达却较低^[3]。

CAST与CAPN结合后能够预防CAPN自溶并进一步抑制CAPN活性。与CAPN酶原比较，CAST与自溶性CAPN的亲和力显著增高，提示由于自我分解而产生的结构和构象改变有助于形成酶–抑制剂复合物^[4]。CAPN/CAST的比值升高，导致CAST对CAPN的抑制作用降低，CAPN活性增强，使CAST降解为小片段并失去其抑制活性^[5]。大鼠CAST序列由N–末端L结构域和4个重复结构域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ区构成，L区是Ca^2＋通道调节区，位于氨基末端。

Ⅰ～Ⅳ区是CAPN抑制区，其对CAPN抑制能力为Ⅰ区>Ⅳ区>Ⅲ区>Ⅱ区^[6]，Ⅰ～Ⅳ区均含有同源性序列Thr–Ile–Pro–Pro–X–Tyr–Arg(X代表任何一种氨基酸)。每个重复结构域含有140个氨基酸残基，均可单独抑制CAPN的活性。CAST 4个重复结构域中保守的抑制性残基聚集成簇，形成A、B和C三个保守区。保守区B与CAPN Ⅱ结构域结合，保守区A和C分别与CAPN的Ⅳ和Ⅵ结构域结合^[7]。

钙蛋白酶抑制蛋白在神经变性疾病中研究最多，涉及到阿尔茨海默病(AD)和帕金森病(PD)。

1．钙蛋白酶抑制蛋白在阿尔茨海默症中的作用：

阿尔茨海默病(AD)是一种神经系统退行性疾病，主要病理改变为大量β淀粉样蛋白沉积形成的神经炎性斑块^[8,9]。研究表明，CAST可能在AD发病过程中发挥重要作用。

CAPN药理抑制作用可以改善AD模型小鼠的记忆和突触传递，过表达CAST在Ca^2＋或钙调蛋白依赖性激酶–2启动子的控制下显著降低淀粉样斑块形成、tau蛋白磷酸化和突触损失，并抑制与记忆相关的分子CREB和ERK的减少。CAST能减少参与淀粉样前体蛋白加工和淀粉样蛋白斑形成的相关酶(BACE1)的产生，抑制记忆相关分子(CREB、ERK)的磷酸化过程^[10]。

最近研究用Tg2576小鼠和同窝出生的野生型小鼠进行对比，发现野生型小鼠CAST在大脑不同区域表达水平不同，其在小脑中含量明显高于在海马、额叶和颞叶皮质中含量，而CAPN水平在这些区域相似。在Tg2576小鼠中，CAST含量降低，CAPN被激活并水解蛋白，尤其在海马中明显，而小脑中CAPN水解作用在这两种小鼠之间无差异。结果认为小脑高水平CAST导致其中CAPN不容易被激活，而大脑其他部分CAST含量低，在Ca^2＋浓度增加情况下CAPN更容易被激活，进而激活的CAPN进一步减少CAST含量^[11]。

另有研究发现与APP23鼠相比，老龄双转基因APP23/CAST鼠神经中过表达CAST可以减少β–淀粉样变性、Aβ水平和APP C–末端片段(CTFS)。此外，老龄APP23/CAST鼠还可以降低细胞外信号调节激酶1和2(ERK1/2)的活性和tau蛋白磷酸化。神经元CAST可以影响APP代谢和Aβ生成^[12]。在CAST基因缺失的实验模型中，Aβ淀粉样变性增强，tau蛋白磷酸化，神经胶质细胞增生和树突营养不良，并且APP转基因鼠死亡率升高，相应地脑中过表达CAST可降低Aβ淀粉样变性，tau磷酸化^[13]。

有报道表明，机体损伤后在退化轴突中观察到CAST消耗，所以在损伤后和AD病情发展过程中CAST是轴突生存的关键点^[14]。在分化的P12细胞中CAST的过量表达能够抑制许多物质，包括sAbeta诱导的CAPN激活、CAPN的活性、胞影蛋白变性、蛋白激酶(cepsilon)及β–连环蛋白、轴突结构改变^[15]。

细胞周期蛋白依赖性激酶5(CDK5)是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，调节亚基P35是其特异的激动剂。P35能在羧基末端第208位裂解成P25和另一大小为相对分子质量10 000的片段，P25具备激活CDK5的功能。由于P25、CDK5缺乏膜锚定基序，致使P25/CDK5在细胞内定位发生改变，持续性地磷酸化其适宜底物，引发病理变化^[16,17]。

CAST可以影响P25异常生成。用野生型(过表达CAST)和CAST基因敲除小鼠脑组织进行分析。与野生型相比，CAST基因敲除鼠提取物中P25含量增加。相反，过表达CAST小鼠裂解液中没有检测到P25。小鼠小脑CAST含量是大脑皮质中的5倍，因此，小脑中P25的含量比大脑皮质中的含量低。这表明，CAST可以抑制CAPN活性，降低P25的生成量，通过TPKⅡ/CDK5途径对tau蛋白过度磷酸化的作用降低。因此，CAST表达减少可能是神经退行性疾病的发病机制^[18]。

2．钙蛋白酶抑制蛋白在帕金森病(PD)中的作用：

PD的病理特征是路易小体，包含聚集的α–突触核蛋白(αSYN)。为了研究体内CAPN对αSYN的裂解作用，对小鼠CAST基因缺陷的[A30P]αSYN转基因小鼠[syncast(–)]和CAST过度表达的[A30P]αSYN转基因小鼠[syncast(＋)]进行实验，发现过表达CAST可以降低αSyn阳性聚集体数量，过表达CAST还可以减少星形胶质细胞增生和钙蛋白酶依赖的突触蛋白降解，潜在地改善[A30P]αSYN和SynCAST(＋)的神经病理学特征^[19]。

有研究指出CAST基因某区域的单核苷酸多态性与PD的发病有关^[20]，然而在中国汉族人群中CAST基因多态性与迟发性散发性PD不存在显著关联^[21]。神经毒素6–羟基多巴胺已被广泛用于PD啮齿动物模型，通过测量CAPN产生的血影蛋白分解产物，6–羟基多巴胺导致侧尾壳核和黑质纹状体的CAPN激活，随后将CAST腺病毒输入纹状体内。出乎意料的是，多巴胺转运蛋白和酪氨酸羟化酶标记显示CAST的神经保护作用存在于腹侧被盖区。当总多巴胺能神经将近耗竭时，CAST发挥主要作用可能不会发生在黑质纹状体多巴胺能通路^[22]。

，从PD死亡病人提取出脊髓(颈、胸和腰段)组织样品进行分析，与年龄匹配正常组织进行比较，研究人员发现从PD病人提取的脊髓组织远端轴突变性，感觉和运动神经元死亡相对较多，对PD脊髓组织进行生化分析，揭示出相关炎症和蛋白水解。因此，脊髓中CAPN活性上调可能有助于炎症反应介导的神经元死亡，导致运动功能障碍。研究者提出在炎症级联反应、神经凋亡途径与神经元死亡过程中CAPN激活和CAPN–CAST调节异常有关^[23]。

1．钙蛋白酶抑制蛋白在亨廷顿病中的作用：

亨廷顿病是一种遗传疾病。亨廷顿病患者体内的CAPN活性增高。应用CAST能显著恢复核因子蛋白(NF–kappaB)的水平，提高细胞成活率^[24]。编码铜/锌超氧化物岐化酶的基因发生突变容易得肌萎缩性侧索硬化症。研究发现此种患者的体内钙离子浓度增高，CAPN活性增强，CAST能降低基因突变带来的毒性作用^[25]。猪鼻支原体能够保护细胞免受CAPN的作用。它能上调CAST的表达，可能会为治疗神经退行性病变提供一种新方法^[26]。

2．钙蛋白酶抑制蛋白在马查多–约瑟夫病(Machado–Jodeph，简称马–约病)中的作用：

马–约病是常见的遗传性小脑共济失调疾病。MJD1基因中过度重复的CAG翻译成聚谷氨酰胺蛋白和ataxin–3蛋白。ataxin–3蛋白的水解会引发马–约病的发生。研究发现CAPN在staxin–3毒性片段形成和马–约病的病理机制中起作用。CAST通过抑制CAPN将突变的ataxin–3蛋白限制在胞质内，防止该蛋白转位到胞核产生毒性作用^[27]。CAST可能成为马–约病的治疗关键点。

外伤性脑损伤导致较高的发病率和病死率。大多数情况下中度和重度外伤性脑损伤的主要特征是弥漫性轴突损伤。有假说认为CAPN参与病理级联过程，在应用以腺病毒为载体介导的过表达CAST大鼠视神经牵拉损伤模型中，过表达的CAST部分保留了轴突运输^[28]。学者发现电针可增强脊髓组织中CAST mRNA的表达，抑制细胞凋亡，减缓大鼠脊髓损伤后的病理损害，保护神经细胞，修复损伤脊髓，其作用与甲泼尼龙相仿。

又有研究发现某些神经系统治疗药物的毒作用也与CAST有关，是一种常见的神经兴奋药，对多巴胺能细胞有神经毒性作用。用其诱导神经细胞瘤细胞SH–SY5Y后，CAPN、Caspase断裂片段增加，细胞活力、酪氨酸羟化酶磷酸化和CAST水平降低。给予外源性的CAST后，上述现象有所好转^[29]。还有研究表明外伤性脑损伤后，过表达CAST能降低海马和脑皮质区CAPN介导的急性血影蛋白水解，并能改善认知能力缺失等脑损伤后行为^[30]。

研究表明，适当剂量的牛磺酸可减少神经衰退和脑梗死体积。使用50 mg/kg的牛磺酸可明显地提高CAST水平和活性；而在大脑中动脉闭塞后24 h半影区，明显降低CAPN和Caspase–3的活性^[31]。另外，抑制CAPN和Caspase–3的活性是在一氧化氮合酶抑制剂对抗大鼠的实验性卒中的机制之一，表明由一氧化氮合酶产生的一氧化氮至少在局部区域参与由CAPN和Caspase–3介导的缺血细胞死亡^[32]。B27–HYD作为一种以CAST为基础的CAPN抑制剂，被开发和用于评估对大鼠卒中后的神经功能障碍，缺血大鼠注入B27–HYD可减少35%梗死体积和44%神经功能缺损^[33]。

此外，在神经系统常见疾病癫痫中还未见钙调蛋白抑制蛋白明确的作用和机制。

在不同的病理条件下，CAST的表达量和CAST与CAPN的比值的高低变化都影响着疾病的发生和发展。在不同的神经系统疾病中，CAPN的根本影响机制不同，根据研究发现CAST在某些疾病的治疗方面具有积极的治疗作用。提前检测神经元中CAST和CAPN含量能否预防疾病发生，CAST是否真正能够治疗一些疾病和能够广泛应用于不同人群还有待研究者去发掘。当然CAST不仅在神经系统疾病发生及发展过程中起重要作用，它与其他疾病也有着密切的联系，因此，CAST在临床治疗上能够有进一步的积极而广阔的应用前景。