信息来源：《药学进展》2015年第9期
通讯作者单位：，天津科技大学生物工程学院
随着生物技术的高速发展，蛋白质多肽类药物不断涌现，已成为21世纪医药研发领域中最活跃，进展最快的药物之一。蛋白质多肽类药物比化学药物更接近于机体内源性物质，具有毒副作用小、不易蓄积导致中毒、疗效稳定等优点，被广泛地应用于癌症、心血管疾病、自身免疫疾病等疾病的治疗，备受国内外药物开发商和研究者的青睐。然而，蛋白质多肽药物仍在临床应用上存在瓶颈：不能直接口服给药，需皮下给药或肌注，在体内不稳定、易被蛋白酶降解、具有较高免疫原性从而容易被机体免疫系统识别，造成其半衰期普遍较短而必须加大给药频率和剂量，使病人的依从性大幅度降低。为克服上述问题，研究人员尝试采用各种化学方法对蛋白质多肽类药物加以修饰，通过修饰可显著改善蛋白多肽类药物的性状，提高药物的生物利用度、延长其在血浆中的半衰期，从而降低用药剂量，减少用药频率。有关蛋白多肽类药物的化学修饰在很多年前就已经开始研究，已经成功应用的修饰方法包括PEG修饰、糖基化修饰和定点突变等等。近年来脂肪酸修饰、Fc片段融合以及白蛋白融合等新一代修饰方案也已有上市产品。本文就蛋白多肽类药物的脂肪酸修饰方法、特点以及药物研发情况进行综述。
将蛋白质多肽分子中不稳定的氨基酸残基定点突变成稳定的残基，可以增加药物的稳定性及生物活性。人胰高血糖素样肽-1（glucagon like peptide-1，GLP-1）的体内半衰期仅2 min。而与GLP-1同源性93%、8位和35位被氨基异丁酸取代的他司鲁肽（taspoglutide）、与GLP-1同源性53%的exendin-4以及在exendin-4的C端添加Lys残基的利西拉肽（lixisenatide，VE0010）等，则不仅能够激动GLP-1受体，且因位点突变能够抵抗体内二肽激肽酶Ⅳ（Dipeptidyl peptidase IV，DPP IV）降解，半衰期均显著延长。其中，exendin-4（exenatide，商品名Bytta/百泌达，艾塞那肽）已在2005年成为第一个获FDA批准用于治疗Ⅱ型糖尿病的GLP-1受体激动剂 。
糖基化修饰是指将寡糖结构与蛋白质多肽分子中某些特殊功能团以共价键相连接，包括N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化以及糖基磷脂酰肌醇修饰等。糖基化修饰可增加空间位阻、提高蛋白质水溶性和稳定性、减少肾小球滤过，从而影响蛋白质多肽类药物的药动学特性、生物学活性、免疫原性和凝聚性等。Huet等用戊糖载体（carrier pentasaccharide，CP）对恩夫韦肽T-20进行修饰，再用PEG连接构成恩夫韦肽-PEG(12)-CP，修饰后大鼠血浆半衰期从2.8 h延长至10 h以上，由此预测人体注射给药频率可由原来的每天2次减为每周1次，半衰期可达120 h。此外，促红细胞生成素（EPO）经过额外增加2个N糖基化修饰后所得到的Aranesp，半衰期延长了3倍，目前也已获批上市。
脂肪酸是细胞膜磷脂的重要成分，能维持细胞膜的流动性并参与细胞膜组装，同时也是构成人体脂肪和类脂的基本物质。因此，脂肪酸修饰的蛋白质多肽类药物有助于提高药物与细胞的亲和性，从而促进上皮细胞对药物的吸收。Hashizume等对胰岛素分子的侧链进行棕榈酸修饰，得到亲脂性更高的棕榈酸酰化胰岛素，同位素示踪检测结果显示：双棕榈酸衍生物的血药浓度显著高于未经修饰的胰岛素，单棕榈酸衍生物则居于二者之间。此外，超氧化物歧化酶（SOD）经棕榈酸、月桂酸等修饰后，亲脂性及稳定性也表现出明显增加，与靶细胞的细胞膜结合也更牢。
氨基酰化是脂肪酸修饰蛋白质多肽类药物的常见方法。在体内，生理性的蛋白质多肽分子氨基端脂肪酸修饰通常是发生在N-末端Gly残基上，多由特异性豆蔻转移酶（N-myristoyltransferase，NMT）催化。体外的氨基端脂肪酸修饰则首先需要进行羧基活化。不同的羧基活化方法将会很大程度上影响后续氨基酰化反应的选择性及修饰后的蛋白质亲疏水性等性质。常用的方法有：①酰氯法，这是其中反应活性最强的方法，然而，该法在水溶液（特别是碱性蛋白质溶液）中易发生水解且选择性差、副反应多，因此修饰率低；②二环己基碳二亚胺（dicyclohexylcarbodiimide，DCC）法，活化羧基得到的是O-酰基脲，反应迅速。但因胺类化合物会促使O-酰基脲重排生成N-酰基脲，所以反应要避免使用三乙胺，尽量使用极性较小的溶剂；③活性酯（N-羟基琥珀酰亚胺酯）法，这是目前业内较常使用的方法。在合适的pH和温度（通常0℃左右）下，N-羟基琥珀酰亚胺酯与氨基相连形成酰氨键，不仅可保留蛋白质多肽分子的生物活性，也可实现位点专一性修饰；④此外，还有酸酐法、活化酰胺法、叠氮化物法等方法。
由于蛋白质多肽链中几种氨基活性差异很小，在进行修饰反应中，很难特定地修饰某一个氨基，修饰后所得的产物大多是混合物。因此，要获得定点修饰的药物纯品，就必须要经过复杂繁琐的分离纯化过程。受到人胰岛素半合成方法的启发，人们开始尝试在蛋白质多肽类药物的修饰领域中改修饰氨基为修饰羧基。例如，先利用羧肽酶A去掉胰岛素B链C末端第一个氨基酸残基，然后利用胰蛋白酶催化将连有脂肪链的氨基酸衍生物与之相连接，形成B链C端被脂肪链修饰的胰岛素衍生物，分析显示该修饰产物在体内更加长效、稳定，且具有潜在的口服功能。
4.3 接头氨基酸介导的脂肪酸修饰
除了直接对蛋白质多肽分子进行脂肪酸修饰之外，还可以先制备脂肪酸修饰的氨基酸，然后通过这一接头氨基酸与蛋白质多肽分子进行连接，在药物中引入脂肪酸修饰侧链。例如诺和诺德（Novo Nordisk）公司的利拉鲁肽和德谷胰岛素，均是以谷氨酸（Glu）作为接头氨基酸，将脂肪酸连接到药物主链的Lys上。
与其他修饰方法相比，脂肪酸修饰的蛋白质药物涉及到更多的化学过程和更为复杂的修饰产物高级结构，药物开发质量控制需要特别考虑以下几个方面。
如前所述，不论是何种修饰，修饰位点的选择都至关重要。一般而言，修饰位点应考虑设计在非活性相关位点区域以免影响多肽蛋白质药物的物理和药理性质。例如，研究表明：对于胰岛素而言，GlyA1的修饰可能会导致降糖活性的部分丧失，而PheB1和LysB29的共价修饰则不仅基本上保持原有的二级、三级结构和生物活性，还几乎完全消除了产物的免疫原性和致敏性，延长了药物的半衰期。分析还显示PheB1和LysB29修饰后物理稳定性均显著增强，且其中PheB1修饰后的稳定性比LysB29修饰产物更强。
③蛋白产品相关杂质的监控。对于蛋白质多肽类药物进行脂肪酸修饰，需要考虑产品相关杂质，针对修饰过程中可能涉及到产品或者中间体敏感的条件，需要特别关注与蛋白质相关的杂质谱变化，例如各种蛋白脱酰胺化杂质、氧化态杂质、旋光异构体杂质、降解物杂质、聚合物杂质、双修饰蛋白质、未修饰蛋白质等，这些杂质均应在产品开发过程中予以关注，其中有些杂质是影响产品关键质量属性（Critical Quality Attribute，CQA）的物质，需要在工艺开发过程中特别重视，对每个杂质进行溯源追踪和风险评估，并根据分析结果予以控制。
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