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循环微小RNA的存在形式及其对急性心肌梗死的诊断价值(上)

心内空间 2020-09-21 11:19:33

  • 中国血脂异常与动脉粥样硬化性心血管疾病防控的新证据和新指南


作者:王红 廖扬 崔翰斌

文章来源:中华心血管病杂志,2018,46(1)

微小RNA(microRNA, miRNA)是一类长度约为22个核苷酸片段的内源非编码RNA,在动植物体内起着重要的调节作用。miRNA最早发现于秀丽隐杆线虫体内,并陆续发现其在细胞内参与信使RNA的调节作用,与多种疾病的形成有关。除了存在于细胞内,miRNA也存在于胞外环境中。

最先发现miRNA存在于胞外的是Chim等,他们发现胎盘中的miRNA出现在孕妇外周血浆中。这些研究开启了人们对胞外miRNA的探索。随后,越来越多的研究表明,miRNA也可以稳定存在于其他体液中,包括唾液、尿液、乳汁、泪液、羊水、支气管肺泡灌洗液、脑脊液、腹膜液和胸膜液等。

在不同体液中,miRNA的类别和浓度存在差异,而且血液中miRNA浓度和类别的变化与多种疾病相关。这提示循环miRNA可以充当一种生物标志物来辅助诊断某些疾病,包括急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)。

目前学者对循环miRNA的生物学意义并未达成共识。本文总结循环miRNA的存在形式及其在急性心肌梗死患者中的诊断价值,以更好地理解胞外循环miRNA的存在意义。

一、循环miRNA的存在形式

由于血液中广泛存在核糖核酸酶,起初人们并不认为miRNA能稳定存在于血液中。直到2007年后,研究先后发现miRNA可以在细胞外和血液两种环境中稳定表达。

目前,血液中的miRNA主要以两种形式存在,一种是以膜来源的胞外囊泡形式存在,另一种是以非囊泡的结合蛋白形式存在,包括脂蛋白如高密度脂蛋白(high-density lipoproteins, HDL)和核糖核蛋白如Ago蛋白。

(一)以囊泡形式存在的循环miRNA

当前,越来越多证据表明血液中具有以胞外囊泡形式存在的miRNA。胞外囊泡指细胞分泌或释放的膜包裹的微粒。根据囊泡的来源不同,胞外囊泡可进一步分为多种亚型,包括核外颗粒(来源于嗜中性粒细胞和单核细胞)、微粒体(来源于内皮细胞和血小板)、前列腺小体(从精液中分离提取)和心肌小体(从心肌细胞分泌物中获得)等。

其中微粒体是近年来心血管疾病的研究热点,许多研究者试图将微粒体与miRNA联系起来,为急性心肌梗死事件的发生和诊断提供新思路。

1.微粒体:

血液中微粒体的水平在多种血管疾病中都会发生变化,可以看作血管疾病的诊断标志物。内皮细胞源性微粒体(endothelial microparticles, EMP)是内皮细胞激活或凋亡时从膜表面脱落的一种囊泡,直径0.1~1.0 μm,表面含有膜蛋白和受体。囊泡内含有各种酶、转录因子、信使RNA和miRNA等。

内皮细胞在生理和病理情况下均可以释放EMP,但囊泡内所含成分不同,血液中EMP及囊泡内miRNA的改变间接反映了内皮的状态。越来越多证据表明,EMP在AMI的发生和诊断中扮演着重要的作用。Zhang等在AMI患者、稳定性冠心病患者和健康者血浆中发现,AMI患者中的EMP和miR-92a水平远高于其余两组,且EMP与miR-92a相关。

两者在AMI中的诊断价值又与心肌肌钙蛋白(cardiac troponin, cTn)的敏感度和特异度相近,可以作为AMI的诊断标志物。除了在AMI中的诊断价值,以EMP形式存在的循环miRNA在心血管疾病的发病过程中也发挥重要的作用,可加快疾病进展或触发修复反应。

Jansen等发现,向颈动脉受损小鼠注射EMP后,颈动脉内皮再生速度增加。他们还进行EMP芯片分析,发现miR-126在EMP中高表达,并进一步发现凋亡的内皮细胞可以释放富含miR-126的EMP,其作用于冠状动脉内皮细胞中的靶蛋白SPRED1,从而影响内皮细胞的迁移、增殖和再生,促进受损内皮修复。他们还发现凋亡的内皮细胞可以释放富含miR-126的EMP,并可以进入血管平滑肌细胞,影响其增殖。

他们进一步对比裸露的miR-126对血管平滑肌的影响,发现只有以EMP形式存在的miR-126才可以抑制血管平滑肌增殖,限制新生内膜形成。以上研究表明,以EMP形式存在的循环miRNA在心血管疾病的发生中发挥重要的作用。

以胞外囊泡形式存在的循环miRNA,除了根据细胞来源进行分类,还可以根据不同的生物学通路模式分为多种亚型,包括外泌体、微囊泡和凋亡小体。

2.外泌体:

外泌体是一类大小为30~100 nm的囊泡,起源于胞内溶酶体途径,通过多泡体质膜融合向内出芽释放。外泌体内不仅含有蛋白质和信使RNA等成分,还含有miRNA。外泌体在生理和病理条件下均可以释放到血液中,并通过囊泡内的成分参与细胞和组织调控。

另外,这种含有miRNA的外泌体与AMI事件的关系也被广泛研究。Khan等发现,胚胎干细胞来源的外泌体可以促进AMI小鼠的血管形成,修复心肌功能。而且,这类外泌体中富含miR-294,胚胎干细胞来源的外泌体可以转运miR-294,促进内皮祖细胞增殖。

急性心肌梗死患者血液中的外泌体中也有miRNA。Yang等报道,AMI患者血液分离得到的外泌体中富含miR-30a,参与心肌细胞缺氧后的自噬调控。

3.微囊泡:

微囊泡不同于胞内溶酶体途径,通常被蛋白质调节和分选,通过质膜脂质结构域以向外出芽的形式外排。Hunter等在血浆中的微囊泡发现了miRNA,这一发现证实miRNA可以以微囊泡的形式稳定存在于循环血中。微囊泡可以使miRNA免受细胞外核糖核酸酶的破坏,促进细胞间的信息交流。

然而,微囊泡是否依赖一种特定的信号方式分泌到血液中,目前仍没有定论。微囊泡往往会与外泌体混一起,由于微囊泡通常较大,且与外泌体有重叠部分,所以尽管学者做了很多尝试,还是很难将微囊泡从外泌体中纯化出来,反之亦然。因此,人们研究的其实是两者的混合囊泡。

4.凋亡小体:

循环miRNA还能以凋亡小体的形式存在。凋亡小体是一类大小为1~4 μm的微粒,是细胞程序性死亡后的残余微粒,是凋亡的副产品。

Zernecke等发现,在动脉粥样硬化过程中,内皮细胞来源的凋亡小体被分泌到细胞外环境中,其内富含miR-126,通过miR-126引起趋化因子CXCL12产生,促进招募Sca-1+造血祖细胞,从而有利于斑块的稳定,并抑制动脉粥样硬化进展。

(二)以结合蛋白形式存在的循环miRNA

miRNA是否只以胞外囊泡的形式存在于细胞外血液中呢?这一观点被Wang等否认,他们在人类纤维原细胞培养基中进行质谱检测,发现12种与蛋白质结合形式存在的胞外miRNA。研究显示,细胞外miRNA在血浆和细胞培养基中主要与Ago蛋白家族的Ago2结合,形成Ago2-miRNA复合体来避免被核糖核酸酶降解,从而稳定存在于血液中。

Turchinovich等的研究表明,循环miRNA可以与其他Ago蛋白如Ago1结合,从而稳定存在于胞外环境中,并提出大多数循环miRNA可能是死细胞的副产品这一假说。虽然学者们认可这种形式的胞外miRNA可以稳定存在于血液中,但尚未有令人信服的证据表明,这类miRNA参与功能性转移。

除了与Ago蛋白结合外,miRNA还可以与核仁磷酸蛋白1(NPM1)结合,从而免受核糖核酸酶的破坏。

近几年也有文献报道,循环miRNA可以与HDL结合。在此之前,HDL一直被看作将肝外细胞内胆固醇转运到肝脏中的载体,与动脉粥样硬化的形成相关。Vickers等发现HDL可以转运循环miRNA,并形成脂蛋白-miRNA复合体,从而避免被核糖核酸酶降解。

他们从血浆中纯化分离得到HDL、低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)和外泌体,发现三者中都含有一定量的miRNA,且三种形式结合的miRNA在同一血样中数量不同。家族性高胆固醇血症患者的血浆中,HDL结合的miRNA水平高于正常人。值得注意的是,这种形式的循环miRNA可以被转运到受体细胞中,抑制mRNA的表达。

靶细胞中许多被调控的基因都与脂质代谢、炎症和动脉粥样硬化有关,这为将来的疾病治疗提供了新的方向。之后Wagner等发现,与HDL大量结合的循环miRNA与LDL结合量很少,而且在正常人与冠状动脉粥样硬化患者血液中,HDL-miRNA在两者之间的表达差异微乎其微。

此外,他们还发现,与HDL结合的循环miRNA不能被转运到受体内皮细胞、平滑肌细胞和外周血单个核细胞中,这表明与脂蛋白结合的循环miRNA不能在所研究的细胞中发挥作用。然而,这与Tabet等的研究结果相悖,其证实HDL可以通过抑制黏附分子-1(ICAM-1)转运miR-223到受体内皮细胞中,具有抗炎的可能性。

与循环miRNA结合的HDL可能仅仅作为血液中运载的miRNA的载体,它在不同受体细胞中的功能仍需进一步研究。与HDL结合的miRNA对于动脉粥样硬化可能有重要的作用,是目前研究的热点。

以上几种存在形式都可以使循环miRNA免受核酶的破坏,从而稳定存在于血液中。而血液中的胞外miRNA主要以哪种形式存在,当前并未有统一的答案。产生分歧的原因可能是由于循环miRNA提取方式和数据标准化处理存在差异。

差速离心、纳米过滤、免疫沉淀反应和排阻色谱均可分离循环miRNA,而对于如何统一循环miRNA的标准化提取方式,还需要进一步研究。

(未完待续【接下文】)