中国血脂异常与动脉粥样硬化性心血管疾病防控的新证据和新指南
作者：王红 廖扬 崔翰斌
文章来源：中华心血管病杂志,2018,46(1)
微小RNA(microRNA, miRNA)是一类长度约为22个核苷酸片段的内源非编码RNA，在动植物体内起着重要的调节作用。miRNA最早发现于秀丽隐杆线虫体内，并陆续发现其在细胞内参与信使RNA的调节作用，与多种疾病的形成有关。除了存在于细胞内，miRNA也存在于胞外环境中。
最先发现miRNA存在于胞外的是Chim等，他们发现胎盘中的miRNA出现在孕妇外周血浆中。这些研究开启了人们对胞外miRNA的探索。随后，越来越多的研究表明，miRNA也可以稳定存在于其他体液中，包括唾液、尿液、乳汁、泪液、羊水、支气管肺泡灌洗液、脑脊液、腹膜液和胸膜液等。
在不同体液中，miRNA的类别和浓度存在差异，而且血液中miRNA浓度和类别的变化与多种疾病相关。这提示循环miRNA可以充当一种生物标志物来辅助诊断某些疾病，包括急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)。
目前学者对循环miRNA的生物学意义并未达成共识。本文总结循环miRNA的存在形式及其在急性心肌梗死患者中的诊断价值，以更好地理解胞外循环miRNA的存在意义。
一、循环miRNA的存在形式
由于血液中广泛存在核糖核酸酶，起初人们并不认为miRNA能稳定存在于血液中。直到2007年后,研究先后发现miRNA可以在细胞外和血液两种环境中稳定表达。
目前，血液中的miRNA主要以两种形式存在，一种是以膜来源的胞外囊泡形式存在，另一种是以非囊泡的结合蛋白形式存在，包括脂蛋白如高密度脂蛋白(high-density lipoproteins, HDL)和核糖核蛋白如Ago蛋白。
（一）以囊泡形式存在的循环miRNA：
当前，越来越多证据表明血液中具有以胞外囊泡形式存在的miRNA。胞外囊泡指细胞分泌或释放的膜包裹的微粒。根据囊泡的来源不同，胞外囊泡可进一步分为多种亚型，包括核外颗粒(来源于嗜中性粒细胞和单核细胞)、微粒体(来源于内皮细胞和血小板)、前列腺小体(从中分离提取)和心肌小体(从心肌细胞分泌物中获得)等。
其中微粒体是近年来心血管疾病的研究热点，许多研究者试图将微粒体与miRNA联系起来，为急性心肌梗死事件的发生和诊断提供新思路。
1．微粒体：
血液中微粒体的水平在多种血管疾病中都会发生变化，可以看作血管疾病的诊断标志物。内皮细胞源性微粒体(endothelial microparticles, EMP)是内皮细胞激活或凋亡时从膜表面脱落的一种囊泡，直径0.1~1.0 μm，表面含有膜蛋白和受体。囊泡内含有各种酶、转录因子、信使RNA和miRNA等。
内皮细胞在生理和病理情况下均可以释放EMP，但囊泡内所含成分不同，血液中EMP及囊泡内miRNA的改变间接反映了内皮的状态。越来越多证据表明，EMP在AMI的发生和诊断中扮演着重要的作用。Zhang等在AMI患者、稳定性冠心病患者和健康者血浆中发现，AMI患者中的EMP和miR-92a水平远高于其余两组，且EMP与miR-92a相关。
两者在AMI中的诊断价值又与心肌肌钙蛋白（cardiac troponin, cTn）的敏感度和特异度相近，可以作为AMI的诊断标志物。除了在AMI中的诊断价值，以EMP形式存在的循环miRNA在心血管疾病的发病过程中也发挥重要的作用，可加快疾病进展或触发修复反应。
Jansen等发现，向颈动脉受损小鼠注射EMP后，颈动脉内皮再生速度增加。他们还进行EMP芯片分析，发现miR-126在EMP中高表达，并进一步发现凋亡的内皮细胞可以释放富含miR-126的EMP，其作用于冠状动脉内皮细胞中的靶蛋白SPRED1，从而影响内皮细胞的迁移、增殖和再生，促进受损内皮修复。他们还发现凋亡的内皮细胞可以释放富含miR-126的EMP，并可以进入血管平滑肌细胞，影响其增殖。
他们进一步对比裸露的miR-126对血管平滑肌的影响，发现只有以EMP形式存在的miR-126才可以抑制血管平滑肌增殖，限制新生内膜形成。以上研究表明，以EMP形式存在的循环miRNA在心血管疾病的发生中发挥重要的作用。
以胞外囊泡形式存在的循环miRNA，除了根据细胞来源进行分类，还可以根据不同的生物学通路模式分为多种亚型，包括外泌体、微囊泡和凋亡小体。
2．外泌体：
外泌体是一类大小为30~100 nm的囊泡，起源于胞内溶酶体途径，通过多泡体质膜融合向内出芽释放。外泌体内不仅含有蛋白质和信使RNA等成分，还含有miRNA。外泌体在生理和病理条件下均可以释放到血液中，并通过囊泡内的成分参与细胞和组织调控。
另外，这种含有miRNA的外泌体与AMI事件的关系也被广泛研究。Khan等发现，胚胎干细胞来源的外泌体可以促进AMI小鼠的血管形成，修复心肌功能。而且，这类外泌体中富含miR-294，胚胎干细胞来源的外泌体可以转运miR-294，促进内皮祖细胞增殖。
急性心肌梗死患者血液中的外泌体中也有miRNA。Yang等报道，AMI患者血液分离得到的外泌体中富含miR-30a，参与心肌细胞缺氧后的自噬调控。
3．微囊泡：
微囊泡不同于胞内溶酶体途径，通常被蛋白质调节和分选，通过质膜脂质结构域以向外出芽的形式外排。Hunter等在血浆中的微囊泡发现了miRNA，这一发现证实miRNA可以以微囊泡的形式稳定存在于循环血中。微囊泡可以使miRNA免受细胞外核糖核酸酶的破坏，促进细胞间的信息交流。
然而，微囊泡是否依赖一种特定的信号方式分泌到血液中，目前仍没有定论。微囊泡往往会与外泌体混一起，由于微囊泡通常较大，且与外泌体有重叠部分，所以尽管学者做了很多尝试，还是很难将微囊泡从外泌体中纯化出来，反之亦然。因此，人们研究的其实是两者的混合囊泡。
4．凋亡小体：
循环miRNA还能以凋亡小体的形式存在。凋亡小体是一类大小为1~4 μm的微粒，是细胞程序性死亡后的残余微粒，是凋亡的副产品。
Zernecke等发现，在动脉粥样硬化过程中，内皮细胞来源的凋亡小体被分泌到细胞外环境中，其内富含miR-126，通过miR-126引起趋化因子CXCL12产生，促进招募Sca-1+造血祖细胞，从而有利于斑块的稳定，并抑制动脉粥样硬化进展。
（二）以结合蛋白形式存在的循环miRNA：
miRNA是否只以胞外囊泡的形式存在于细胞外血液中呢？这一观点被Wang等否认，他们在人类纤维原细胞培养基中进行质谱检测，发现12种与蛋白质结合形式存在的胞外miRNA。研究显示，细胞外miRNA在血浆和细胞培养基中主要与Ago蛋白家族的Ago2结合，形成Ago2-miRNA复合体来避免被核糖核酸酶降解，从而稳定存在于血液中。
Turchinovich等的研究表明，循环miRNA可以与其他Ago蛋白如Ago1结合，从而稳定存在于胞外环境中，并提出大多数循环miRNA可能是死细胞的副产品这一假说。虽然学者们认可这种形式的胞外miRNA可以稳定存在于血液中，但尚未有令人信服的证据表明，这类miRNA参与功能性转移。
除了与Ago蛋白结合外，miRNA还可以与核仁磷酸蛋白1(NPM1)结合，从而免受核糖核酸酶的破坏。
近几年也有文献报道，循环miRNA可以与HDL结合。在此之前，HDL一直被看作将肝外细胞内胆固醇转运到肝脏中的载体，与动脉粥样硬化的形成相关。Vickers等发现HDL可以转运循环miRNA，并形成脂蛋白-miRNA复合体，从而避免被核糖核酸酶降解。
他们从血浆中纯化分离得到HDL、低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)和外泌体，发现三者中都含有一定量的miRNA，且三种形式结合的miRNA在同一血样中数量不同。家族性高胆固醇血症患者的血浆中，HDL结合的miRNA水平高于正常人。值得注意的是，这种形式的循环miRNA可以被转运到受体细胞中，抑制mRNA的表达。
靶细胞中许多被调控的基因都与脂质代谢、炎症和动脉粥样硬化有关，这为将来的疾病治疗提供了新的方向。之后Wagner等发现，与HDL大量结合的循环miRNA与LDL结合量很少，而且在正常人与冠状动脉粥样硬化患者血液中，HDL-miRNA在两者之间的表达差异微乎其微。
此外，他们还发现，与HDL结合的循环miRNA不能被转运到受体内皮细胞、平滑肌细胞和外周血单个核细胞中，这表明与脂蛋白结合的循环miRNA不能在所研究的细胞中发挥作用。然而，这与Tabet等的研究结果相悖，其证实HDL可以通过抑制黏附分子-1(ICAM-1)转运miR-223到受体内皮细胞中，具有抗炎的可能性。
与循环miRNA结合的HDL可能仅仅作为血液中运载的miRNA的载体，它在不同受体细胞中的功能仍需进一步研究。与HDL结合的miRNA对于动脉粥样硬化可能有重要的作用，是目前研究的热点。
以上几种存在形式都可以使循环miRNA免受核酶的破坏，从而稳定存在于血液中。而血液中的胞外miRNA主要以哪种形式存在，当前并未有统一的答案。产生分歧的原因可能是由于循环miRNA提取方式和数据标准化处理存在差异。
差速离心、纳米过滤、免疫沉淀反应和排阻色谱均可分离循环miRNA，而对于如何统一循环miRNA的标准化提取方式，还需要进一步研究。
（未完待续【接下文】）