[摘要] 综合运用硅胶，Sephedax LH20，RP8，MCI等柱色谱及硅胶薄层制备色谱，从桑黄子实体的95%乙醇提取物中分离纯化得到11个化合物，通过NMR和MS解析技术鉴定为3α羟基木栓烷2酮（1），3羟基木栓烷3烯2酮（2），麦角甾4，6，8 （14），22四烯3酮（3），麦角甾醇过氧化物（4），尿嘧啶（5），尿嘧啶核苷（6），4（3，4二羟苯基）3丁烯2酮（7），原儿茶醛（8），inotilone（9），inoseavin A（10），phellibaumin E（11），其中化合物1，2，5，6为首次从该属真菌中分离得到。采用Cell TiterGLo ATP荧光活性检测法，11个化合物对41株离体肿瘤细胞和2株正常仓鼠细胞高通量筛选，结果显示化合物2～4对髓性白血病细胞系NOMO1和SKM1效果较好，其中化合物2，3体现出较好的选择性（对NOMO1的IC50分别为0.795 5，1.828 μmol・L-1；对SKM1的IC50 >10 μmol・L-1）；化合物7对肺癌细胞系H526、前列腺癌细胞系DU145、白血病细胞系HEL效果较为明显（IC50分别为0.533 4，1.885，1.057 μmol・L-1），并显示出较好的选择性；其他化合物体外抗肿瘤作用不显著或没有活性。此外，所有化合物对正常仓鼠细胞系CHL和CHO均无明显作用（IC50 >10 μmol・L-1），显示所有化合物对正常细胞无毒副作用。
中国论文网 /1/view-7474119.htm
[关键词] 桑黄； 化学成分； 抗肿瘤活性
桑黄又名桑臣、桑耳、猢狲眼等，来源于锈革孔菌科针层孔菌属真菌火木针层孔菌Phellinus igniarius （L.ex Fr.） Quel的子实体，主要分布于中国东北、华北、西北及四川、云南等地，在日本、韩国、朝鲜等东亚国家也有分布。桑黄是一种传统名贵中药，素有“森林黄金”之美称，主要用于治疗血崩，血淋，脱肛泻血，带下，闭经等妇科疾病。研究表明其具有抗肿瘤、免疫调节、抗肝纤维化、抗氧化、降血糖、消炎抗菌等药理作用。尤其，近年来由于其显著的抗癌功能，桑黄已经成为国内外研究的热点，是目前国际公认的生物治癌领域中有效率最高的真菌。大量研究表明多糖类物质是桑黄抗肿瘤的主要活性成分，目前关于小分子单体化合物的抗肿瘤活性研究报道较少。本研究期望通过对桑黄95%乙醇提取物的化学成分研究，从桑黄中获得结构多样的天然产物，再运用高通量筛选技术寻找抗肿瘤活性显著成分，为进一步深入研究桑黄化学成分及其药理活性奠定基础。
1 材料
Bruker AM400型超导核磁共振仪；VG Autospec3000型质谱仪；RC1显微熔点仪（四川大学科仪厂）；ZFI紫外分析仪（上海顾村电光仪器厂）；HSGF254型和GF254型薄层色谱硅胶板（烟台江友硅胶开发有限公司）；柱色谱硅胶（200～300目，青岛海浪硅胶干燥剂厂）；制备型薄层色谱板（200 mm×200 mm）；Sephadex LH20 gel（25 ～ 100 μm，Pharmacia公司）；RP8 MB（100 ～ 40/75 μm，Fuji Silysia化工）；MCIgel CHP20P （75～150 μm，日本三菱化工）；化学试剂均为分析纯；Envision多功能酶标仪（Perkin Elmer 公司）；Cell TiterGlo试剂盒（Promega公司）。
实验药材桑黄由安徽省大别山康美来生物科技有限公司提供，为人工种植品种，经安徽大学生命科学学院王开金教授鉴定为桑黄P. igniarius，标本保存于安徽医科大学药学院天然药化教研室。
2 提取与分离
干燥的桑黄样品（6 kg）粉碎后用95%乙醇提取4次，提取液浓缩成浸膏（875 g）后用蒸馏水悬浮， 再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。
石油醚部分（65 g）经硅胶柱色谱，用石油醚乙酸乙酯（60∶1～1∶1）洗脱，得6个组分（S1～S6）。S3～S6分别经硅胶柱色谱，用石油醚乙酸乙酯（60∶1～10∶1）洗脱，S3得3个组分（S31～S33），S4得4个组分（S41～S44），S5的6个组分（S51～S56），S6得3个组分（S61～S63）。S32经硅胶柱色谱，用石油醚乙酸乙酯（30∶1）洗脱，得化合物1（34 mg）。S43经凝胶sephadexLH20柱色谱，氯仿甲醇（1∶1）系统洗脱，得化合物2（43 mg）。S56和S62经制备薄层硅胶板，分别以石油醚乙酸乙酯（10∶1）和石油醚乙酸乙酯（2∶1）作为展开剂，在紫外灯254 nm下刮下所要的荧光条带，再用氯仿洗脱，最后结合重结晶和凝胶sephadexLH20柱色谱进行纯化，得化合物3（40 mg）和化合物4（86 mg）。
乙酸乙酯部分（482 g）经硅胶柱色谱，用氯仿乙酯（2∶1～1∶3）洗脱，得6个组分E1～E6。E1经硅胶柱色谱，氯仿乙酯（18∶1～1∶1）洗脱，得5个组分（E11～E15）。E14 和E13分别经凝胶sephadex LH20柱色谱，用纯乙醇洗脱后，再经RP8中压柱色谱，用甲醇水（10%～70%）系统梯度洗脱，得化合物7（65 mg）和化合物8（76 mg）。E3依次经过凝胶sephadexLH20柱（乙醇）、硅胶柱（氯仿甲醇50∶1～1∶1）和RP8中压柱（10%～70%甲醇）纯化后得化合物9（34 mg）。E6依次经过MCI开放树脂柱（10%～70%甲醇）、MCI中压柱（10%～100%甲醇）、RP8中压柱（10%～80%甲醇）、凝胶sephadex LH20柱（纯乙醇）分离纯化后得化合物10（23 mg），11（22 mg）。
水部分（25 g），依次经过中压MCI树脂柱（甲醇水0～20%）、凝胶Sephadex LH20柱（甲醇水0～5%）、RP8开放柱（水）、凝胶Sephadex LH20柱（甲醇）分离纯化后得化合物5（30 mg）和化合物6（35 mg）。 3 结构鉴定
化合物1 无色片状晶体，易溶于氯仿。
4 体外抗肿瘤活性的测定
采用Cell TiterGLo ATP荧光活性检测法对化合物1～11进行体外抗肿瘤活性检测，初步对41株人肿瘤细胞以及2株仓鼠正常细胞进行高通量筛选，结果见表1。
化合物1～11用DMSO溶解，用细胞培养液稀释。将对数生长期的人肿瘤细胞悬液接种于384孔白色微孔板，1×103个/孔，每孔加培养基50 μL，孵育24 h后，加入适当浓度梯度的受试化合物。设置两种阴性对照用于校准：只加培养基的调零孔；只加DMSO处理的对照孔，>5%孔/板。培养3 d后添加Cell TiterGlo试剂，10 μL/孔。用酶标仪检测
5 结果和讨论
本实验从桑黄的95%乙醇提取物中分离得到11个化合物，其中化合物1，2，5，6为首次从桑黄该属中发现，进一步丰富了桑黄的化学成分。
化合物2～4对急性髓系白血病细胞系NOMO1和SKM1体外增殖能力有明显的抑制作用，其中化合物2，3体现出较好的选择性（对NOMO1的IC50分别为0.795 5， 1.828 μmol・L-1；对SKM1的IC50均>10 μmol・L-1）；化合物7对肺癌细胞株H526、前列腺癌细胞株DU145、白血病细胞株HEL均有较强的抑制作用（IC50分别为0.533 4，1.885，1.057 μmol・L-1），并显示出较好选择性；其他化合物体外抗肿瘤作用不显著或无活性（IC50均>10 μmol・L-1）；11个化合物对仓鼠正常细胞株CHL， CHO均无抑制作用（IC50>10 μmol・L-1），显示这11个化合物对正常细胞无毒副作用。结果见表1。
除了表1中的13种肿瘤细胞株以外，本实验还检测了化合物1～11对以下28株肿瘤细胞体外增殖能力的作用：人肺癌细胞株A549， PC9， H1975， H1395， H2030， H1915， H358， H1755， 2009， H23， H2887，人膀胱癌细胞株T24， EJ， Hbc，人结肠癌细胞株HCT116，人宫颈癌细胞株Hela，人皮肤癌细胞株A431，人前列腺癌细胞株RV1，人乳腺癌细胞株MDAMB，人胃肠间质瘤细胞株GISTT1，人淋巴癌细胞株JVM2， REC1，人白血病细胞株CMK， K562， MOLM13， MOLM14， F382， TELBAF3CKIT。实验结果表明，11个化合物对以上28株肿瘤细胞均无抑制作用（IC50 >10 μmol・L-1）。
大量研究报道已证实化合物3和4具有显著的抗肿瘤活性。Lee等报道化合物3对人肝癌Hep3B、人结肠癌HT29、人子宫颈癌HeLa229、人胃癌AGS细胞增殖抑制作用的IC50分别为12.7，18.4，67，56.1 μmol・L-1；赵英永等的研究显示化合物3对人肝癌细胞HepG2、人喉癌细胞Hep2、人子宫颈癌细胞HeLa的增殖有一定的抑制作用（IC50分别为10.5，14.6，10.8 mg・L-1）；Thi等的研究显示化合物3对人肺癌细胞LU1具有一定毒性（IC50=10.21 mg・L-1）。化合物4对肺癌细胞NCIH187具有较强的毒性（IC50=5.81 mg・L-1），对多发性骨髓癌细胞U266也具有明显细胞毒活性；化合物4对胃癌MKN45 、结肠癌LOVO、肺癌A549、乳腺癌MDAMB435、肝癌HepG2、白血病细胞HL60增殖抑制的IC50分别为10.26， 9.77， 11.12， 8.61， 12.84， 4.41 mg・L-1。Kwon等的研究显示化合物3和化合物4对肺癌细胞A549、卵巢癌细胞SKOV3、皮肤黑色素瘤细胞SKMEL2，中枢神经细胞XF498和结肠癌细胞HCT15均具有一定的细胞毒活性。以上报道中化合物3对子宫颈癌细胞HeLa、化合物4对肺癌细胞A549和乳腺癌细胞MDAMB435与本实验中的结果一致，抑制细胞增殖的IC50 >10 μmol・L-1；本实验并未对以上报道中的其他细胞进行抗肿瘤活性实验。
目前未见关于化合物2抗肿瘤活性的报道。本实验结果证明化合物2具有抗肿瘤活性，其对淋巴癌细胞TMD8、急性髓系白血病细胞NOMO1增殖抑制的IC50分别为3.876， 0.795 55 μmol・L-1。
Zan等的研究结果显示化合物7对人乳腺癌细胞MCF7和人肝癌细胞HepG2均无细胞毒活性，本实验中未对化合物7进行这2种肿瘤细胞株筛选，却发现其对肺癌细胞H460，H526，结肠癌细胞COLO205，前列腺癌细胞DU145，人骨肉瘤癌细胞U2OS，白血病细胞SKM1， NB4， HEL均有一定的细胞毒活性（IC50分别为8.684，0.533 4，7.698，1.885，8.021，3.266，3.088，1.057 μmol・L-1），尤其对H526， DU145， HEL的增殖抑制作用更为明显。
对桑黄抗肿瘤活性的研究多集中在桑黄多糖类成分[1316]，目前对于小分子化合物的抗肿瘤活性研究报道较少。本实验首次采用了高通量筛选技术对桑黄中的单体成分进行抗肿瘤活性筛选，实验选取了41株人肿瘤细胞以及2株仓鼠正常细胞，结果进一步证明了桑黄乙醇提取物中的小分子化合物具有抗肿瘤功效，并且证明化合物2～4，7均具有显著的抗肿瘤活性。研究结果为桑黄作为抗肿瘤药物提供理论依据，为桑黄的进一步开发和利用奠定基础。
以文会友！转发分享是最好的鼓励和支持