【冯仁丰】互换性依然是问题---铜蓝蛋白的参考物质未被重新确认(二)

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三、铜蓝蛋白未被批准为ERM-DA470k/IFCC一个成分的原因

2013年Zegers等报告了新参考物质对铜蓝蛋白互换性的研究和证实。ERM-DA470k/IFCC是被制备替代ERM-DA470/IFCC（原CRM470）的。1993年发布的该参考物质以血清为基础，是14种蛋白包括铜蓝蛋白的参考物质。自此之后有相当多的报告认为它改善了常规临床实验室检测程序间对数种蛋白的一致性。但是该物质在制备和以后为各个蛋白定值的过程中没有被确认互换性。在以后的应用中，出现ERM-DA470不能使病人样品中的铜蓝蛋白结果实现一致性，因为它缺少互换性。

  

自新的ERM-DA470k正式发布以来，Zegers等为了更多了解铜蓝蛋白为什么不能被确定为该参考物质中一个确认的蛋白，按照CLSI的EP30-A文件进行了互换性实验。实验观察的结果大致如下。

1、初始决定铜蓝蛋白不是ERM-DA470k/IFCC中一个确认蛋白的原因。

开始在制备ERM-DA470k/IFCC替代ERM-DA470时，需要确认ERM-DA470k/IFCC的铜蓝蛋白浓度。当时定值中由13个实验室参与，使用了BNProSpec、BNⅡ、Olympus AU640、Immage、Abbott、和LX-2200等检测系统，Hitachi使用了Roche和Dako试剂。这些检测均以ERM-DA470校准。对新鲜病人样品检测发现：Immage和Abbott方法得到高值，而Olympus、Roche、和Dako Hitachi方法给出低值。在还不能充分了解问题原因前，制备者作出了不列入铜蓝蛋白的决定。

2、互换性实验安排

在实验中使用了各个公司均号称可溯源至ERM-DA470的铜蓝蛋白产品。对人血清样品进行检测比对。这些血清有被添加了叠氮钠、储存于-70℃15个月的“陈旧”血清30份；也有新鲜的血清样品，即不添加任何防腐剂与深低温保存的。另外参考物质样品：1支ERM-DA470、3支冷冻干燥的ERM-DA470k/IFCC（12个蛋白的确认值）、3支深低温冰冻的ERM-DA472/IFCC（有CRP蛋白的确认值）。ERM-DA470k/IFCC和ERM-DA472/IFCC来自相同的处理过的混合血清，但保存方式不同。（注意：三种参考血清中，ERM-DA470是1993年制备的，为年份最老；ERM-DA472是新制备的、专用于CRP的液体参考物质；ERM-DA470k/IFCC为新制备的、与ERM-DA470一样的参考物质。）

有8个实验室使用不同检测系统参加实验。所有参与实验的各个检测系统依然使用ERM-DA470校准，对实验样品检测。

3、检测系统间比较

血清样品得到的不同方法检测结果均值CV为1.7%和6.1%。Pearson相关系数对所有配对方法比较均大于0.98，说明不同方法间结果有非常好的相关。但方法比较的斜率从0.56到1.42。这些值显示了相同血清样品的检测结果，在不同方法间非常离散。

尽管每个检测系统均具有良好的溯源性，可溯源至ERM-DA470。但是它们在检测新鲜患者样品时，两两检测系统间比较的回归斜率差距，只能说明ERM-DA470在检测系统间缺乏了相当的互换性。

4、新鲜血清和各个参考物质在不同检测系统间比对

依然使用ERM-DA470为各个检测系统校准后，各个检测系统检测新鲜病人血清样品与ERM-DA470、ERM-DA470k、和ERM-DA472参考物质的比对结果，以回归统计归纳分析。下图C为Beckman Immage和Dako Hitachi的比对。由图说明整个血清铜蓝蛋白检测结果，Dako Hitachi明显低于Beckman Immage，以Beckman Immage为准的斜率约0.56。最奇怪的是三个参考物质在这两个系统进的比对时，却均在血清检测回归统计的95%分布范围之外；特别是ERM-DA470对于回归线的偏离最大。充分说明这三个参考物质与这些新鲜病人血清在这两个系统比较中，没有互换性。图D是Abbott系统与AU2700系统的比对。回归线的斜率为0.92；所有三个参考物质均在血清比对的95%分布范围内。图示说明这三个参考物质在这两个系统的比对中，与病人血清具有互换性。

图中红色圆点为ERM-DA470的结果；蓝色三角点为新制备ERM-DA470k的结果；绿色的方块但为新制备ERM-DA472的结果。

5、EQAS数据

Zegers观察到添加叠氮钠后冰冻储存的血清（文献中被称为“陈旧”血清），在检测系统比对中，与新鲜病人血清表现不一，但它们很像EQAS样品或像参考物质那样的表现。发现新参考物质ERM-DA470k/IFCC表现像新鲜病人样品。有提议认为，在储存中铜蓝蛋白结构的变化，导致抗原-抗体结合特性的改变。但是，需要做进一步研究才可全面理解因存放过程导致分子的改变。

四、互换性问题的复杂性

参考物质和新鲜病人样品中铜蓝蛋白间，在各个检测系统间没有互换性。这是没有对参考物质ERM-DA470k/IFCC确定铜蓝蛋白定值的根本原因。

综合目前对互换性问题的理解，大致上可以认识下述各点：

1、至今出现互换性问题的分析物（平时称为检验项目），其实都是一个大家族。也许我们连真正被检测的那个分析物分子及其结构完全不了解。追求溯源性的重要原则是，必须在参考物质和新鲜病人样品中被检测系统检测的是相同的被测量（Measurand）。可惜，我们对许多许多分析物的被测量是什么还不知道，何谈溯源性！因此，明确分析物的被测量是实现互换性、一致性、乃至溯源性是第一个大事。

2、按照溯源性分类要求，一级参考物质应该是纯物质，二级参考物质是含有基质的物质。为了获取参考物质，必须对样品进行各种分离、纯化手段。任何对原始样品的处理、提取，都是对原先样品中分析物的破坏或损害。因此，即使得到了某个参考物质，极有可能本身已经丧失了原先的分析物的分子结构，至少被修饰或丢失了始终在一起的某个分子或片段。所以，也许只有小分子物质的纯化产物可以是原先在天然样品中的那个分析物分子。可是，今天在追求溯源性的大多是免疫方法为检测手段的较大或大型分子。有了抗体就会建立免疫方法进行检测。期望形成参考物质时，不断实践才发现问题的复杂性。肌钙蛋白I的参考体系的困难。就是一个示例。

3、为了关注检测样品中的基质状态，二级参考物质以诸如血清等为基础，添加部分分析物（被部分纯化的某分析物、或纯分析物、或来自动物来源的某些物质），也加入防腐剂（如：叠氮钠）等；最后被冷冻干燥。为了使这样的参考物质在冻融时不会出现浑浊，事先去除血清中的a脂蛋白；可是又引入了更多的处理和去除更多原血清中的成分。所有这些，使制备的参考物质与新鲜病人血清间产生了许多尚不了解的差异。这些差异不仅是被检测分子的差异，更是非分析物组成的基质差异。凡此种种，使这样的参考物质与新鲜病人血清的互换性遭遇了严重问题。

4、任何一个物质不稳定是绝对的，稳定是相对的。刚刚制备的参考物质在发布时非常完美，与新鲜病人血清间呈现出良好的互换性，使许多检测系统对新鲜病人样品的检测结果间实现了一致性，也许会确实被某些组织确认它的溯源性。可是随着参考物质的存放时间延长，分析物分子或参考物质基质二者或任一个可能发生微小变化，会出现原先互换性变化、分析物定值的变化等。

五、互换性依然是问题

被仰望的参考物质，曾经在大家的心目中是最神圣的，它应该是正确性的象征。可是随着科学技术的不断发展，人们对自然的深入了解，现在也对参考物质的可靠性在逐渐认识。这不是什么倒退，而正是使我们的认识更加贴近真实。

实现临床实验室大家期望的梦，在任何时候、任何地方、使用任何方法（检测系统），可以对相同的病人样品得到相同的结果，这是我们的愿望。为了这个梦，我们的前辈为此做了许多的努力。面对新的认识，临床实验室的人不会知难而退，相反会更加激励我们共同努力，克服每一个难关。总有一天我们会实现我们的理想的！

我一直认为，如果我们在任何时候始终以新鲜病人样品为我们实验的对象，始终以方法学比较作为度量是否实现可比性，去度量使用的校准品或控制品是否与病人样品间具有互换性，我相信我们的实验室结果可比性一定会不断改善。

这也是这位Dr. Miller那篇社论的真实含义。由衷希望我们的临床实验室同仁不断刻苦学习和实践，使我国的临床实验室检测质量不断改善。

 

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