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蛋白桑:桑叶提取物1-DNJ 对小菜蛾幼虫生物活性的影响

蛋白桑兴农 2020-05-21 16:03:00

摘要:为研究桑树叶片生物活性物质1-DNJ的杀虫作用机理,以小菜蛾(Plutella xylostella L.)为研究对象,利用桑树叶片提取物1-DNJ饲喂小菜蛾3 龄幼虫,研究1-DNJ对小菜蛾拒食、触杀、胃毒和生长等生物活性的影响。结果表明,1-DNJ处理后,小菜蛾48 h 和72 h 的拒食率分别是93.33%和89.25%,拒食中浓度为0.34 和0.58 g/L。同时,1-DNJ 对小菜蛾幼虫的生长发育具有明显抑制,小菜蛾化蛹率随着1-DNJ浓度增加而显著下降,但对小菜蛾的蛹重作用不大。1-DNJ对小菜蛾的触杀和胃毒作用效果没有拒食和生长抑制的作用明显。结果说明,桑树叶片中的1-DNJ主要通过拒食作用影响小菜蛾生长,进而达到防控的目的。

关键词:桑树;1-DNJ;小菜蛾;生物活性

0 引言

小菜蛾(Plutella xylostella L.)是世界范围内十字花科蔬菜的重要食叶性害虫之一,被认为是分布最为广泛的鳞翅目昆虫。小菜蛾主要以幼虫危害十字花科蔬菜叶片而降低蔬菜的产量和品质,危害严重时可造成减产90%以上,甚至绝收。小菜蛾一年发生多代、世代间虫口数量增长快以及世代重叠等,导致防治困难。目前,防治小菜蛾的方法多是通过各种化学农药,由于用药频繁,加之小菜蛾生活史的特殊性,造成小菜蛾及其幼虫对大约50 多种杀虫剂都产生了抗药性。由于人们的环保和食品安全意识的增强,生物源农药的研究与应用渐渐受到重视,而且将微生物农药和植物源农药作为重点发展方向。目前,已有多个品种的植物源农药问世,但是应用范围狭窄,没有在生产中广泛应用。黑龙江省是国内绿色食品生产基地,植物源农药具有广阔的应用前景。

        桑树(Morus alba L.)叶片中的1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin, 1-DNJ)能够抑制α-糖苷酶的活性,通过抑制体内蔗糖的消化吸收及糖代谢而对鳞翅目昆虫产生毒性。前期研究发现,在栽植桑树的附近地区种植秋白菜受到小菜蛾的危害显著降低,为探明其原因及其作用机制,笔者利用桑树叶片中提取的1-DNJ处理小菜蛾3 龄幼虫,研究其对小菜蛾拒食、触杀、胃毒、生长以及化蛹率等的影响,为促进植物源农药的开发提供技术资料。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点

试验于2011 年6 月在东北林业大学植物生理实验室内进行。

1.2 试验材料

供试小菜蛾虫卵购自中国科学院动物研究所。将虫卵置于长成6~8 片叶时的甘蓝幼苗上,虫卵孵化和幼虫生长的环境温度保持(25±3)℃,相对湿度为55%~75%,光周期16:8(光:暗)的条件下。待幼虫孵化后自由取食,及时更换新鲜甘蓝苗,挑选健康且大小一致的小菜蛾3龄幼虫进行试验。1-DNJ 为本实验室从桑树叶片中提取的样品,经大孔树脂纯化后得到纯度98%的样品,提取和纯化按照李宇亮等方法。

1.3 试验设计

将无公害的甘蓝叶统一裁成2 cm×2 cm规格大小的叶片,将1-DNJ 配成4 个浓度梯度处理,即0.25、0.50、1.00、2.00 g/L,分别将各浓度1-DNJ 对裁剪好的叶片进行处理,以清水处理为对照,共计5个处理。

1.4 生物活性的测定

1.4.1 选择性拒食率的测定采用浸渍叶碟法,将裁好的甘蓝小叶分别置入不同浓度1-DNJ溶液及清水中浸泡1 min,取出后,等叶片上溶液完全挥发,再放入培养皿中。每个培养皿内等距离排放4 片裁好的小叶片(对照与处理各2片),每皿中置放30头小菜蛾幼虫,每个处理重复4 次。分别于24、48 h 后用坐标纸测量出被取食的甘蓝叶片面积,利用DPS专业分析软件求出回归方程,相关系数和拒食中浓度AFC50值。选择性据食率=对照取食量- 处理取食量对照取食量+ 处理取食量× 100%

1.4.2 试虫生长抑制率的测定将裁好的甘蓝小叶分别放入处理药液或清水中浸泡1 min,取出后,等叶片上溶液完全挥发,每盒培养皿放入2 片裁好的甘蓝小叶,接入饥饿3 h 的小菜蛾幼虫20 头,每个处理重复4 次。分别在处理后第0、24、48、72 h称取试虫重量并及时更换处理叶片。

1.4.3 试虫触杀死亡率的测定采用浸虫法,将饥饿3 h的小菜蛾幼虫放入滤网中,将其浸于不同浓度1-DNJ溶液中5 s 后取出,用滤纸吸干虫体上多余药液。将试虫置于放有新鲜甘蓝叶片的培养皿中,每处理20 头,重复4 次。于24、48、72 h 后调查死亡情况,及时更换新鲜叶片。

1.4.4 试虫胃毒死亡率的测定采用浸叶法。将裁好的甘蓝小叶分别放入处理药液和清水中浸泡60 s,取出后,等叶片上溶液完全挥发,再放入培养皿中,每皿2

片。每个处理置试虫20 头,重复4 次。于处理后24、48、72 h检查幼虫死亡情况,及时更换新鲜处理叶片。

1.4.5 试虫化蛹率的测定利用叶片夹毒法饲喂小菜蛾4 龄幼虫。用电子天平称裁好的甘蓝小叶100 片的重量,计算每个甘蓝小叶重量,按每克叶片含不同浓度1-DNJ 将其滴于裁好的甘蓝小叶碟上,对照叶片点滴清水,均匀抹平后,用琼脂将另一叶片粘上做成夹毒叶片,喂饲小菜蛾48 h后,再用正常甘蓝叶片喂饲直至化蛹,每个处理所获得蛹数不少于50 只,记录各处理小菜蛾的蛹数和蛹重,重复4次。

1.5 数据分析

图中数据为4 次重复的平均值±标准差标准误,运用Microsoft Office Excel 2003 和DPS7.5 软件对试验数据进行统计分析,并采用单因素方差分析(one-wayANOVA)和最小显著差异法(LSD)比较不同数据组间的差异。

2 结果与分析

2.1 1-DNJ对小菜蛾幼虫的拒食作用

小菜蛾3 龄幼虫的取食经1-DNJ处理的甘蓝小叶的情况见表1。多重比较结果表明,不同浓度处理间以及与对照组的差异都达到显著水平(P<0.05)。3 龄小菜蛾幼虫的取食量随着1-DNJ 浓度升高而减少,其拒食率也随着1-DNJ浓度升高而提高。与处理后24 h结果相比,处理48 h 后各供试3 龄小菜蛾幼虫的拒食率均有所下降。以拒食率值为y 值,1-DNJ 浓度对数为x 值,分别求得1-DNJ 对小菜蛾幼虫24 h 和48 h 的毒力回归方程,即y=1.0448-0.2664x 和y=3.9283-1.7715x,相应的拒食中浓度(AFC50)分别为0.34 和0.58 g/L,小菜蛾幼虫经浓度为1 g/L 的1-DNJ 处理后,24 h 检测的拒食活性较48 h 检测的高出36.89%,而拒食中浓度仅为48 h 的58.62%。

2.2 1-DNJ对小菜蛾幼虫生长的抑制作用

表2 结果显示,对照组的小菜蛾幼虫体重在48 和72 h 分别比24 h 增加了56.3%和119.4%。0.25 g/L1-DNJ处理的试虫体重在48 h 和72 h 分别比24 h 增加了17.8%和47.8%。1 g/L1-DNJ处理的试虫体重在48 h和72 h 分别比24 h 增加了10.23%和21.39%。在同一时间处理范围内,随着1-DNJ浓度的增加,小菜蛾3 龄幼虫体重增加量逐渐减少。多重比较检验结果表明,各处理间以及与对照组的差异都达到显著水平(P<0.05)。但随着1-DNJ 浓度的升高,试虫体重增长就越发缓慢,当1-DNJ 浓度为2 g/L 时,各处理时段的试虫体重差异不显著(P<0.05)。说明高浓度的1-DNJ对小菜蛾幼虫的体重具有极强的抑制作用。

     表3 反映了1-DNJ 对小菜蛾3 龄幼虫生长发育的抑制情况。1-DNJ 的浓度越高,供试幼虫的生长受到抑制越明显,不同浓度1-DNJ 处理间以及与对照组之

间均达到显著差异水平(P<0.05)。当1-DNJ 浓度高于1 g/L时,对小菜蛾3龄幼虫生长发育抑制率在24、48和72 h 时均高于86%以上;浓度2 g/L 处理,小菜蛾幼虫生长发育抑制率均高于95%以上,但各检测时间段处理间差异不显著(P<0.05)。

2.3 1-DNJ对小菜蛾幼虫的触杀作用

1-DNJ对小菜蛾3 龄幼虫的触杀结果(表4)显示,相同时段内随着1-DNJ 浓度的增加,小菜蛾幼虫的触杀死亡率与校正死亡率增加。相同浓度的1-DNJ 处理,死亡率与校正死亡率随时间呈上升趋势,最高值出现在1-DNJ浓度为2 g/L 处理72 h 后,死亡率和校正死亡率分别达到63.33%和53.70%,处理间以及与对照组的差异均达到显著水平(P<0.05)。说明1-DNJ对小菜蛾幼虫具有一定触杀作用,且浓度越高触杀作用越明显。

2.4 1-DNJ对小菜蛾幼虫的胃毒作用

相同时间检测结果表明,小菜蛾3 龄幼虫的胃毒死亡率与校正死亡率均随1-DNJ 浓度的增加而升高(表5)。同一浓度处理中,死亡率与校正死亡率随处理时间的的延长而增加,最高值出现在1-DNJ 浓度为2 g/L 处理72 h,死亡率和校正死亡率分别达到70.00%和57.64%。方差分析结果表明,各处理间以及与对照组的差异均达到显著水平(P<0.05)。说明1-DNJ对小菜蛾3 龄幼虫具有胃毒作用,且浓度越高其胃毒的作用越明显。

2.5 1-DNJ对小菜蛾化蛹和蛹重的影响

不同浓度1-DNJ 处理甘蓝小叶饲喂小菜蛾幼虫48 h 后,对小菜蛾的蛹重和化蛹率影响的总体趋势见表6。化蛹率随着1-DNJ 浓度升高而下降,方差分析表明,浓度处理间的小菜蛾的化蛹率均达到显著水平(P<0.05),而小菜蛾的蛹重在各浓度处理间差异不显著(P<0.05)。以处理组蛹重占对照的百分比值为y值,1-DNJ浓度对数为x 值,求得回归方程和抑制中浓度(EC50);以处理组化蛹率占对照的百分比值为y 值,1-DNJ 浓度对数为x 值,求得回归方程和抑制中浓度(EC50);得出1-DNJ处理48 h 后小菜蛾蛹重比率的EC50为2.34 g/L,化蛹率的EC50 为0.37 g/L,其结果说明1-DNJ对于小菜蛾蛹重的影响较小。

3 讨论

近年来,由于全球气候变暖,甘蓝、油菜等十字花科蔬菜种植区域的北移,使得小菜蛾幼虫逐渐成为北方地区十字花科蔬菜的长发性害虫,而化学杀虫剂的

长期使用,使小菜蛾幼虫的抗药性增强。左一鸣等报道,微生物杀虫剂阿维菌素对小菜蛾具有较好的防治效果,但其田间建议用量是LC50的10~20 倍,同时生产中需要筛选天然的菌株以及生产成本高的问题,大大限制了阿维菌素地推广应用。植物源农药由于植物与昆虫长期协同进化作用而不容易产生抗药性,是开发新型杀虫剂的重要来源,而生物农药,尤其是植

物源农药逐渐受到重视。植物源活性物质对昆虫具有多种作用,研究发现,从楝科植物中分离的川楝素对菜青虫、小菜蛾等害虫具有胃毒、拒食作用,抑制生长发育;吴文君等[18]报道苦皮藤根皮粉提取物对昆虫具有拒食、麻醉和毒杀作用;而闹羊花素-III 对粘虫和菜青虫等害虫的作用较为复杂,除了拒食、毒杀、生长发育抑制和产卵忌避作用外还有内吸作用。本研究结果表明,桑叶中的1-DNJ 对小菜蛾的生长和化蛹有着明显的抑制作用,48 和72 h 的拒食率分别达到93.33%和89.25%,而且桑树1-DNJ对小菜蛾的触杀和胃毒却明显小于拒食,说明1-DNJ 影响到了小菜蛾的生长发育进程,这可能与1-DNJ 在生物体内的作用密切相关。一般情况下,在动物和昆虫体内,多糖类必须经多种酶的降解形成单糖后才能被体内吸收,α-糖苷酶(包括蔗糖酶、麦芽糖酶、异麦芽糖酶、海藻糖酶等)是降解多糖的常见酶。葡萄糖、乳糖、麦芽糖等可直接经由

Na+依赖性机制(Na+载体)进入细胞内,而果糖是经扩散通过细胞膜进入细胞内[20]。1-DNJ具有竞争性抑制α-糖苷酶的活性,能与活性部位发生竟争性结合,阻滞双糖分解为单糖,延缓糖类的吸收,这样多糖在昆虫体内的逐渐积累,就造成了昆虫的拒食,使得昆虫的体重下降,延缓了化蛹率。至于桑树1-DNJ 在试验中表现的胃毒作用,可能是由于饲喂含有1-DNJ之后,表现出的消化道的消化能力减退造成的,而不是1-DNJ 作用的直接结果,这需要进一步研究证实。

       桑树是国内栽培面积较大的多用途农林兼用树种,随着国家“东桑西移,南蚕北移”工程及优惠政策的实施,北方寒冷地区蚕桑业的快速发展,特别是在东西部干旱地区,栽植桑树,建设桑树生态园,达到防风固沙、治旱和增加农民收入的多重效果,可作为各地农村产业结构调整的首选项目。经过课题组多年研究,北方桑树中1-DNJ 含量明显高于南方,利用桑树可大量生产植物源农药,在农业生产中必将发挥重要作用。

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