基因工程与蛋白质工程(拓展+真题)

【知识点总结】

一、基因工程
基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。

（一）基因工程的基本工具：

1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）

（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。

（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链     中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。

（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。

2.“分子缝合针”——DNA连接酶

（1）两种DNA连接酶（E•coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较：

 ①相同点：都缝合磷酸二酯键。

 ②区别：E•coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。

（2）与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。

3.“分子运输车”——载体

（1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。
③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。

（2）最常用的载体是--质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。

（3）其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒

（二）基因工程的基本操作程序

第一步：目的基因的获取
1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。

2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。

3.PCR技术扩增目的基因

（1）原理：DNA双链复制

（2）过程：第一步：加热至90～95 ℃DNA解链；第二步：冷却到55～60 ℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75 ℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。

第二步：基因表达载体的构建

1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。

2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因
（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。

（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。

（3）标记基因的作用：鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。

第三步：将目的基因导入受体细胞

1.转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

2.常用的转化方法：
将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。

将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。

将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：先用 Ca2+处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。

3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。

第四步：目的基因的检测和表达
1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。

2.其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用用标记的目的基因作探针与 mRNA杂交。

3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原－抗体杂交。

4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。

（三）基因工程的应用

1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。

2.动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。

3.基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。

二、蛋白质工程的概念

蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）

1.蛋白质工程的基本原理：它可以根据人的需求来设计蛋白质的结构，又称为第二代的基因工程。

2.基本途径：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）是蛋白质工程特有的途径；以下按照基因工程的一般步骤进行。（注意：目的基因只能用人工合成的方法）

3.设计中的困难：如何推测非编码区以及内含子的脱氧核苷酸序列。

【高考真题链接】

（2015年•全国卷Ⅱ第40题）

40.[生物——选修3:现代生物科技专题](15分)

已知生物体内有一种蛋白质(P),该蛋白质是一种转动蛋白,由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸,240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸,改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能,而且具有了酶的催化活性。回答下列问题:

(1)从上述资料可知,若要改变蛋白质的功能,可以考虑对蛋白质的_____ 进行改造。

(2)以P基因序列为基础,获得P1基因的途径有修饰_____ 基因或合成_____ 基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的,中心法则的全部内容包括_____ 的复制;以及遗传信息在不同分子之间的流动,即_____ 。

(3)蛋白质工程也被程为第二代基因工程,其基本途径是从预期蛋白质功能出发,通过_____ 和_____ ,进而确定相对应的脱氧核苷酸序列。据此获得基因,再经表达、纯化获得蛋白质,之后还需要对蛋白质的生物_____ 进行鉴定。

【答案】(15分)

氨基酸序列(或结构)(1分,其他合理答案也给分)

PP1(每空2分,共4分)DNA和RNA(或遗传物质)(2分)

DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)(3分)

(3)设计蛋白质的结构 推测氨基酸序列(每空2分,共4分)　功能(1分)

【考点】本题考查蛋白质工程。

【解析】(1)蛋白质的结构决定蛋白质的功能,题中蛋白质P更改2个氨基酸后,不但保留原有功能,还具有了酶的催化活性,所以可以通过改造蛋白质的结构来改变蛋白质的功能。

(2)获得新的基因序列可以通过对原有基因的修饰或者利用化学方法人工合成,所以可以修饰P基因或合成P1基因。科学家克里克总结了遗传信息传递的一般规律,并把它命名为中心法则。包括DNA的复制、转录、翻译、逆转录、RNA的自我复制等过程。

(3)蛋白质工程的基本途径是从预期蛋白质的功能出发,设计预期的蛋白质结构,推测应有氨基酸序列,找到相对应的脱氧核苷酸序列。经过表达获得的蛋白质,还要鉴定其生物功能。

（2015•江苏卷第32题）

32.(9 分)胰岛素A、B 链分别表达法是生产胰岛素的方法之一。图1 是该方法所用的基因表达载体,图2 表示利用大肠杆菌作为工程菌生产人胰岛素的基本流程(融合蛋白A、B 分别表示β -半乳糖苷酶与胰岛素A、B 链融合的蛋白)。请回答下列问题:

 图2

(1)图1基因表达载体中没有标注出来的基本结构是_____ 。

(2)图1中启动子是_____ 酶识别和结合的部位,有了它才能启动目的基因的表达;氨苄青霉素抗性基因的作用是_____ 。

(3)构建基因表达载体时必需的工具酶有______ 。

(4)β -半乳糖苷酶与胰岛素A 链或B 链融合表达,可将胰岛素肽链上蛋白酶的切割位点隐藏在内部,其意义在于_____ 。

(5)溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端的肽键,用溴化氰处理相应的融合蛋白能获得完整的A 链或B 链,且β -半乳糖苷酶被切成多个肽段,这是因为_____ 。

(6)根据图2 中胰岛素的结构,请推测每个胰岛素分子中所含游离氨基的数量。你的推测结果是_____ ,理由是_____ 。

【答案】(1)终止子

(2)RNA聚合　作为标记基因,将含有重组质粒的大肠杆菌筛选出来

(3)限制酶和DNA连接酶

(4)防止胰岛素的A、B链被菌体内蛋白酶降解

(5)β-半乳糖苷酶中含多个甲硫氨酸,而胰岛素A、B链中不含甲硫氨酸

(6)至少2个　两条肽链的一端各有一个游离的氨基,氨基酸R基团中可能还含有游离的氨基

【考点】本题考查基因工程的相关知识。难度适中。

【解析】(1)基因表达载体包括复制原点、启动子、终止子、标记基因和目的基因,图1基因表达载体缺少终止子。

(2)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,启动目的基因转录;氨苄青霉素抗性基因是标记基因,能够将含有重组质粒的大肠杆菌筛选出来。

(3)构建基因表达载体需要的工具酶是限制酶和DNA连接酶。

(4)将胰岛素肽链上蛋白酶的切割位点隐藏在内部,可防止胰岛素的A、B链被菌体内蛋白酶降解。

(5)由于β-半乳糖苷酶中含多个甲硫氨酸,而胰岛素A、B链中不含甲硫氨酸,所以用溴化氰处理相应的融合蛋白,可获得完整的A链或B链,β-半乳糖苷酶被切成多个肽段。

(6)胰岛素共有两条肽链,每条肽链的一端各有一个游离的氨基,而氨基酸的R基中可能还含有游离的氨基,所以每个胰岛素分子中至少含有2个游离的氨基。

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