高分SCI文章揭示蛋白质组学研究策略

蛋白质组学在近十几年得到了飞速发展，从传统的免疫亲和、免疫组化实验，到基于质谱仪的蛋白质组检测，检测通量得到大幅提升，准确度和精确度也大大提高。而基于质谱的蛋白质组检测方法，近几年也是新技术不断发展，如数据非依赖采集技术（DIA）、平行反应监控（PRM）等。

 

那么，在新的技术浪潮下，如何结合这些技术进行蛋白质组学的实验设计与研究方案呢？

 

基迪奥生物结合丰富的项目经验，为各位老师总结出了下面这个实用的蛋白质组学研究策略：

 

 

具体步骤

① 首先根据研究目的，对研究材料（植物、动物、微生物样本等）采用非靶向蛋白质组学（untargeted proteome）技术，如shutgun蛋白检测、蛋白标记与非标记定量、蛋白修饰定量等进行生物样本蛋白质组的检测，筛选目标候选蛋白；

 

② 然后利用基于质谱的MRM/PRM、基于抗体的westernblot、ELISA等靶向检测方法，验证目标候选蛋白的表达量；

 

③ 最后进行目标蛋白的机制研究，研究其生理功能与作用机制。

 

下面我们就通过解读一篇2017年发表在《Journalof Proteome Research》（IF：4.268）上的文章，来学习该蛋白质组学研究策略是如何运用到课题研究的，以及是怎样发表高分文章的。

 

本文研究的是B细胞分化发育过程中的关键转录因子：早期B细胞因子1（EBF1）。有报道称Ebf1单倍剂量不足可诱发白血病。因此本文利用DIA和shutgun DDA技术对 Ebf1+/+ 细胞和 Ebf1+/- 细胞的蛋白质组进行检测和比较，研究Ebf1杂合性和剂量对祖B淋巴细胞（pro-B）蛋白质组的影响。

 

实验设计

研究材料：祖B淋巴细胞两种基因型：Ebf1+/+细胞和Ebf1+/-细胞

 

检测方法：每个基因型测三个生物学重复，DDA和DIA分别测6个run

 

 

靶向验证方法：PRM、Western blot验证、qPCR验证

 

蛋白功能分析：IPA，GO功能富集分析，ChIP-seq

 

研究结果

 

1

DDA 与 DIA结果的比较

文章除了围绕研究目的进行蛋白质组学检测，还别出心裁地分别进行了DDA和DIA两种不同采集模式的检测，用真实数据来比较DDA和DIA，证明新技术DIA的优势。这种比较两种技术的文章现在越来越多了，上次我们就解读了一篇DDA与DIA技术比较的文章，结果当然是DIA完胜DDA（具体请戳这里查看）。

在鉴定蛋白与肽段方面，DIA比DDA鉴定出更多的肽段和蛋白（DDA：平均每个重复样本鉴定到55015条肽段和5471个蛋白group；DIA：平均每个重复样本鉴定到约60000条肽段和约5700个蛋白group），并且生物学重复样本间的重现性更高（图1 A,B）。

 

在差异蛋白分析方面，DIA比DDA得到更多的差异蛋白（图1 C），其中共有75个差异蛋白是在DIA和DDA中都鉴定到的，这些差异蛋白的变化趋势都高度一致（图1 D），说明了DIA与DDA方法的一致性。

 

需要注意的是，关键转录因子如EBF1, Pax5, TCF3等的表达量，无论是在DDA还是DIA的结果中都是在Ebf1+/-细胞中表达下调。

 

总结：DDA和DIA数据都很好，一致性较强，而DIA更胜一筹。

 

 

图1 DDA与DIA结果的比较

 

2

目标蛋白验证

文章分别利用了PRM，western blot和qPCR的方法验证EBF1蛋白等转录因子表达量的下调。

western blot结果表明了Ebf1+/-祖B细胞中EBF1,Pax5, TCF3蛋白表达量的减少，并且表达量减少了至少两倍（图2 A,B）。

 

利用PRM方法对5个蛋白进行验证（EBF1, Pax5, TCF3, BCL2，TNPO3），其中TNPO3不是差异蛋白，用做对照。PRM结果显示与DIA的结果高度一致，即差异变化趋势与倍数高度一致（图2 C）。

 

利用qPCR验证这些差异表达蛋白的编码基因的表达量。结果显示与蛋白DIA、PRM结果高度一致（图2 D）。

 

图2 目标蛋白验证

 

3

差异蛋白的功能分析

对DIA鉴定得到的174个差异蛋白进行功能分析，14个差异蛋白为转录因子，其中8个转录因子直接参与了B淋巴细胞的分化，如IRF4，EBF1，SPI1，TCF3等（图3 B）。

 

利用IPA的“上游分析”功能分析蛋白组变化相关的分子功能，结果发现“转录因子”是引起Ebf1杂合性导致的蛋白组变化的最大功能组别（图3 C）。这些结果说明了EBF1转录因子调控了很多其他转录因子的表达，EBF1蛋白表达水平的变化可导致很多其他转录因子表达异常。

 

利用网上下载的ChIP-seq数据，分析EBF1,Pax5, TCF3是否能直接结合这174个差异蛋白编码基因。结果显示98个基因可与至少其中一个转录因子结合，20个基因可与这三个转录因子结合（图3 D）。

 

图3 差异蛋白的功能分析

 

为了更深入地研究174个差异蛋白在祖B淋巴细胞分化中的生物学功能，利用IPA对这些差异蛋白进行功能调控网络的构建。

结果显示这些差异蛋白参与了B淋巴细胞的细胞增殖与分化、细胞周期、细胞凋亡等生物学过程，祖B淋巴细胞的生成受到复杂的基因网络所调控，不同转录因子之间相互作用，共同调控祖B淋巴细胞的生成（图4）。

图4 祖B淋巴细胞的功能调控网络 

 

总   结

1. DIA和DDA的结果都表明了Ebf1+/-祖B细胞中EBF1转录因子表达量下调。

2. 其他B细胞转录因子，如TCF3和Pax5，在Ebf1+/-祖B细胞中同样表达量下调。

3. 对差异表达蛋白进行功能分析发现，EBF1杂合性导致至少8个参与淋巴细胞增殖的转录因子表达异常，从而影响了祖B淋巴细胞的存活、发育和分化。

 

本文很好地运用了开头我们所总结出的蛋白质组学研究策略，即首先使用非靶向蛋白质组学技术进行生物样本的蛋白质组的检测与筛选；然后运用PRM、western blot和qPCR的方法靶向验证目标蛋白；最后对目标蛋白进行了功能分析和机制研究。研究思路完整清晰，逻辑缜密，值得我们好好学习。如果机制研究方面能够更深入，应该能够发更高分的文章。

TIPs：

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今天的内容就到这里啦~

参考文献：

Musa Y R, Boller S, Puchalska M, et al.Comprehensive Proteomic Investigation of Ebf1 Heterozygosity in Pro-BLymphocytes Utilizing Data Independent Acquisition.[J]. Journal of ProteomeResearch, 2018, 17(1):76.