WesternBlot---细胞总蛋白的含量测定

  蛋白质的定量，目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford法（考马斯亮蓝法）、BCA法、Lowry法（Folin-酚试剂法）等。但各有优缺点，客户可以根据具体情况选取。

（1）蛋白质定量试剂盒 (BCA法)

这是一种较新的、较为敏感的蛋白测定方法。要分析的蛋白在碱性溶液里与 Cu²⁺反 应产生 Cu⁺，后者与 BCA 形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在 562 nm 波长。其优点是：（1）此化合物与蛋白浓度的线性关系极强，反应后形成的化合物非常稳定；（2）所受干扰小，其显著特点是不受去垢剂的影响。其缺点是：（1）有脂类存在时其光吸收值会明显提高；（2）蛋白样品中的EDTA或葡萄糖含量高于10mM时不能使用这种方法。详情请关注http://www.applygen.com/a/danbaidingliang/94.html

（2）Bradford法蛋白质定量试剂盒

这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应，产生的有色化合物吸收峰 595 nm。其优点是：（1） 敏感度好，是 Lowry 和 BCA 两种测试方法的2～4 倍；（2）操作更 简单，速度更快；（3）只需要一种反应试剂；（4）反应在2分钟内达到平衡并在１小时内保持稳定；（5）而且与一系列干扰 Lowry，BCA 反应的还原剂（如 DTT，巯基乙醇）相容。其缺点是：（1）仍有干扰，如SDS、去污剂、Triton x100等，标准曲线因有干扰而有轻微的非线性；（2）最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。http://www.applygen.com/a/danbaidingliang/167.html

本实验仅以Bradford 方法为例。

㈠ 试剂

1. 4mg/ml BSA 标准蛋白液：10μl/管，4℃保存。临用前，加入70μl 生理盐水，配制成0.5mg/ml。

2. 5×Bradford 试剂

3．考马斯亮蓝G-250 使用液

a. 考马斯亮蓝G-250 母液： 称取考马斯亮蓝G-250 100mg,溶于50ml 95%乙醇；加入100ml 85%浓磷酸(w/v)。过滤，4℃保存6个月。

b. 考马斯亮蓝G-250 使用液（ 0.01%考马斯亮蓝G-250）：

取考马斯亮蓝G-250 母液15ml加蒸馏水稀释至 85ml(临用前稀释 )

㈡ 仪器 分光光度计及玻璃比色皿

㈢ 实验步骤

1. 稀释5×Bradford 试剂：如欲配制15ml 考马斯亮蓝使用液, 则： 5×Bradford 试剂3ml, 蒸馏水12ml, 充分混合；

2． 稀释BSA 标准品及制作标准曲线：

用生理盐水或PBS 将0.5mg/ml牛血清白蛋白（BSA）标准蛋白液分别稀释成0、2、4、6、8、10ug/100ul(分别编号：1、2、3、4、5、6、)浓度；

3．向上述不同浓度BSA 管中分别加入1.5ml Bradford 使用液， 混合均匀后移至玻璃比色皿中，于紫外分光光度计上测定595nm 吸光度值（OD595），依据所得数据制作标准曲线；

4．稀释待测蛋白样品：

吸取细胞总蛋白样品2 ul，加入98ul生理盐水或PBS（总体积为100ul），混合均匀后加入1.5ml 考马斯亮蓝使用液，混匀后测定595nm 吸光度值（OD595）；

5．计算样品总蛋白含量（ug/ul）：

根据标准曲线图，找出样品蛋白在图中的位置，计算出蛋白含量。

（四） 注意事项

1．制作的BSA 标准曲线如不规律，应重新再做。

2． 如果待测样品浓度高（如组织提取物），可用生理盐水稀释10～20 倍后测定；如样品浓度低，可适当增加样品ul 数及减少生理盐水或PBS 的ul 数

3． 比色皿的清洁： 考马斯亮蓝不易被清水冲洗干净，因此使用后的比色皿除用清水冲洗后，还需用无水乙醇将比色皿浸泡数分钟以脱色，而后分别用自来水、蒸馏水冲洗后备用。