【冯仁丰】心肌肌钙蛋白检测:理解分析特性和它们对临床护理影响的指导(7)

 检验观点 | 每周一更新 

Clinical Chemistry, 63:1,73-81(2017),Mini-Reviews

背景：心肌肌钙蛋白I（cTnI）和心肌肌钙蛋白T（cTnT）的测定是临床实践和研究的心血管疾病的固定检测项目。心肌肌钙蛋白检测已经是出现急性冠脉综合征（ACS）和非-ACS心肌伤害患者诊断急性心肌梗死（AMI）、早期排除、风险分类、和后果评估实践的标准。我们对过去多年的文献阅读认识到，使用这些检测的实验室人员、临床医生、和科学家对cTnI和cTnT检测的分析特性理解非常差。

内容：本综述的目的是:

（a）确定空白限值、检出限值、定量限值、和不精密度；

（b）综述现有心肌肌钙蛋白检测的分析特性；

（c）为确定第99百分位数需要的健康（正常）参考人群，和用于这个计算的相应统计学；

（d）阐明如何将一个检测方法被指定为“高灵敏度”；

（e）提供对确定delta（Δ）改变值的指导。

总结：本综述提升了关于cTnI和cTnT检测、它们的因性别差异的第99百分位数参考上限（URL），和特别进行高-灵敏度（hs）-检测用于检测低浓度等的重要教育信息。形成推荐，协助明确术语和分析和临床特性，去确定hs-检测方法的临床特性。本综述也明确为涉及将hs-检测方法引入临床实践的挑战。期望随着这些概念的引入，实验室、临床医生、和研究者可形成一个更一致的观点，应对这些检测方法如何全球使用。

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心肌肌钙蛋白I（cTnI）和肌钙蛋白（cTnT）测定是诊断急性心肌梗死（AMI）做法的标准，当使用高敏（hs）-检测方法已经为早期排除获得了接受。心肌肌钙蛋白也对具有急性冠脉综合征（ACS）和非ACS的心肌injury损害患者的风险分类和后果评估很重要。已经变得很明显的是，使用cTnI和cTnT检测的人对这些检测的理解会如此之差。通过阅读对等-评审研究的方法部分是证据，认识到cTnI和cTnT检测的分析特性趋向被不如实叙述，以及在研究与研究间如何确定相应的判断限、第99 百分位数的参考上限（URL）等均需进行教育。

  

因为对心肌组织特异性，cTnI和cTnT检测已经置换了肌酸激酶同工酶MB（CK- MB）。当cTnI依然对这个概念是真实的；研究近期已经展现了，免疫-反应蛋白，是否cTnT异构体或其他蛋白，确实看来与Roche市场上cTnT检测有交叉反应，在神经肌肉疾病病理学的小型亚组已经研究了。临床医生需要懂得cTnT检测会发生非心肌升高的可能性（近期发生这样的升高看来很小，但不清楚），如果存在骨骼肌肉病理问题，会导致对心肌损害的假阳性诊断。

 

hs-cTn检测正开始在全球接受使用，但在美国还没有被FDA批准。很重要的是，心肌肌钙蛋白用户真的没有忽视理解，当代的和POC检测依然保持着在临床实践中，分享了很大的市场。本综述的目的是，叙述cTnI和cTnT检测特性的重要性。本综述没有想代替现有的导则，但是确实提供了在多个领域的推荐，依据检测特性，使心肌肌钙蛋白检测的最佳利用。

心肌肌钙蛋白检测（CardiacTroponin Assays）

心肌肌钙蛋白T

hs-cTnT（第五代）检测（Roche Diagnostics）使用了2个cTnT-特定的鼠单克隆抗体的抗原结合片段（FAB），直接抗人cTnT的中心区域的表位（抗原决定簇）。捕获抗体（M7）是生物素化的，直接抗以往的第四代检测中相同的、在氨基酸残基125~131的表位。检出抗体是直接抗在氨基酸残基136~147的表位。原先的抗体（M11.7）已经被再设计，FAB的恒定C1区域被人IgG C1区域取代，产生了一个鼠-人嵌合的检出抗体。检测相对于重组的人cTnT校准，该物质由大肠杆菌（Escherichia coli）细胞培养产生。检测校准与第四代检测不相同，所以相同样品以第四代的和hs-cTnT检测产品检测的，给出不同的结果。第四代的第99百分位数的参考上限（URL）为10 ng/L，相当于hs-cTnT检测为30 ng/L。

 

心肌肌钙蛋白I

MAB（单克隆抗体）对cTnI的不同表位的特异性，可识别在血液中循环的多个修饰物。不同形式的cTnI抗原，用作标准或校准品协助改善了不同市售检测产品间的相关约超过10倍，但是没有标准化。IFCC工作组进行了是否可以达到cTnI的一致性，预示了以混合血清为基础的二级参考物质的可能性。即使使用了一个数学公式，在检测间的一致性依然太难。cTnI检测离散的最常见的原因是，用于不同检测产品中抗体的表位特异性差异。即使检测应用了相似的抗体，还是得到不同的数量浓度。cTnI检测受多个因素影响，包括蛋白水解降解、磷酸化、和与cTnC的复合物、肝素、嗜异性或人抗鼠抗体、以及特异的cTnI自动抗体。MAB仅被选择在这样一个途径，若MAB之一（捕获的或检测的）对样品中存在的某个抗原敏感，则其他MAB应对相同抗原是不敏感的。cTnI已经展现了在某个AMI后坏死的心肌肌肉保温期间被内源性的蛋白水解酶切断。大量（＞95%）的血液内cTnI出现成为一个二元 cTnI-cTnC复合物。考虑检测包括一个抗cTnC抗体，在改善分析灵敏度上很有用。用于检测的抗体应以等摩尔基础识别所有循环的心肌肌钙蛋白形式。

 

定义：空白限值（LoB）、检出限值（LoD）、和定量限值（LoQ）

随着hs-检测方法的出现，和强调在第99 百分位数URL的检测不精密度（%CV）、以及定量限值（LoQ），连同使用空白限值（LoB）和检出限值（LoD）一起，作为早期排除AMI的判断限，要理解为什么这些值是重要的；所有这些都是分析参数，用于叙述心肌肌钙蛋白检测低浓度。理解这些词语与形成临床证据建议关联，即在“不可检出水平”的浓度处，小于无论是LoB或LoD，依据非常高的阴性预期值（NPV）和很高的临床灵敏度，使用单次心肌肌钙蛋白检测结果，临床医生可潜在安全地排除AMI。当某样品含有某个心肌肌钙蛋白检测产品的0校准品进行双份检测时，预期可发现的最高心肌肌钙蛋白浓度为LoB。统计上，经常表达为：LoB = 均值（0校准品）+ 1.645 × SD（0校准品）。

在美国，LoB不是临床上可报告的，由于在这个浓度处有很高的不精密度（%CV ＞20%）使得这个浓度处的结果不可靠，你不应使用。临床利用LoB浓度目前不明确。LoD，大于LoB的浓度，是对含有某个低心肌肌钙蛋白浓度的某样品，可检出的最低心肌肌钙蛋白浓度，它可靠地与LoB区分，可以确信地报告供临床使用。在美国，实验室也许不能报告在LoD处的心肌肌钙蛋白，因为目前可用的当代（检测pre-hs-assay“超hs的一代产品”）和POC心肌肌钙蛋白检测，在这个浓度处的不精密度＞20%；但FDA仅允许厂商报告的心肌肌钙蛋白检测结果具有某个%CV（总不精密度）≤ 20%处的最低浓度。这样，最低的心肌肌钙蛋白浓度，应展现了20% CV，被确定为LoQ。

 

在第99百分位数处的总不精密度

心肌肌钙蛋白检测以天间不精密度被确定为%CV，是使用二者多批试剂和校准品在多天内检测确定的。CLSI EP5-A2文件详细地介绍不精密度评价方案，它做法扩展为20天、每天2批、使用2个不同批号的试剂和校准品。作为临床使用，心肌肌钙蛋白检测已经被认为：如果它们在第99百分位数具有的% CV ≤ 10%，为“导则可接受”；如果%CV 在＞10%到≤ 20%，则“是临床上可使用的”；如果% CV＞20%，则“不是临床上可接受的”。hs-检测方法具有很少的分析影响，在第99百分位数处符合临床-实践导则精密度的推荐（% CV ≤ 10%）最高标准，而当代的和POC心肌肌钙蛋白检测在第99 百分位数具有的% CV在10%~20%间。使用hs-cTn检测减少了分析影响，使得真正心肌肌钙蛋白的报告升高大于第99百分位数，指示心肌损害，而不是因分析不精密度造成心肌肌钙蛋白结果的升高，因此，改善了诊断准确度。第三个全球MI定义导则（the thirduniversal definition of MI guideline），推荐有限使用在第99百分位数处总CV ≤ 10%的检测方法，但是也支持使用CV ≤ 20%的，因为一个20% CV不会导致对患者在诊断或风险评估管理上的错误分类。

表1显示了，所有hs-cTn检测在第99百分位数处达到的CV ≤ 10%。这样的信息对实验室人员和临床医生很有用，因为它让他们有信心报告hs-cTn值，以及在一段时间内心肌肌钙蛋白结果的系列改变，不受分析影响。检测的% CV如何好的真实实验，只要实验室每次进行质量控制，将可以使临床实践每天使用检测结果。目前，仅Abbott hs-cTnI和Roche hs-cTnT在临床实践中使用，看来已经保持了在第99百分位数处＜10%的质量特性。当代的检测经常在厂商产品说明书报告，达到了在第99 百分位数处的10% CV，但是在临床实验室实践中很少能做到。

 

第99 百分位数（99th pecentile）

心肌肌钙蛋白的第99百分位数参考上限（URL），相当于是诊断AMI的临床实践指导浓度。这个URL经典地来自表面上的健康个体，在研究中由厂商或研究者征集参考个体。对于hs-cTn检测，IFCC的心肌生物标志物临床应用工作组（TF-CB）已经提议推荐确定第99百分位数。性别是影响第99百分位数的重要的因素，在使用hs-检测方法时，推荐报告给临床使用性别特定的第99百分位数。当代的和POC检测不具有因性别使第99百分位数有适当差异的分析灵敏度，因此只要求单个包括所有（男性加女性）的第99百分位数限值。hs-cTn检测使用单个诊断心肌肌钙蛋白临界值，在研究hs-cTnT中被限制，已经展现了对女性AMI诊断不足；但若以性别特定的各个判断限，则男性和女性诊断AMI的比例是相似的。对于hs-检测方法，心肌肌钙蛋白结果应以ng/L的整数报告，以区分它们是来自当代的和POC检测。虽然全球认可，但第99百分位数依然没有一致地应用在临床实践。仅30%到50%的实验室报告使用第99百分位数，因此在实践中折中了AMI的诊断，以及在临床试验中以心肌梗死（MI）为终点。（这里是否意味着不是急性心肌梗死为中心，而是变成以心肌梗死为最终目标？）尽管hs-cTn检测浓度随年龄增加，看来因并存病所致，以及URL随年龄的改变，对临床试验会增加复杂性和对较健康老人是问题。

 

为确定第99百分位数定义健康参考人群

对当代的、POC、和hs-检测方法的第99百分位数，可见表1 。在确定的第99百分位数上，登记的个体组成或数量的一致性很差。定义什么是一个健康参考个体的构成，是争论的内容。是否个体看来是健康的、年轻个体、或他们应是年龄-配对没有已知心血管疾病的患者、类似于确认为AMI患者的人口统计资料、年龄要30~90岁？你如何确定某人是健康的？是否被选择的个体是：（a）通过个人回答，是否服用已知为心脏药物，如他汀；（b）在得到信息后，有无与心血管疾病有关的已知疾病，如肾病或糖尿病；或（c）通过规定的医师评价的某个体，在取得病史和体格检查后，是否包括心电图或造影？第三个选项，若理想，是否费用有限制？以这个基础相继选择的某个参考人群，已经展现了使导出的第99百分位数偏移到较低值。我们推荐了一个二重方式，年轻人（＜30岁）和较大年龄（＞30岁，具有中位数年龄为60~65岁，是心脏病患者的代表），招聘了表面上健康参考组。

应依据服药病史数据（不是心脏药物）、已知潜在疾病、血液检测、使用脑钠肽浓度（依据检测），可提供为排除心衰的一个高NPV，作为潜在心肌功能失调的一个替代生物标志物，以及一个估计的肾小球滤过率（eGFR）＞ 60 ml · min-1m-2，为确定潜在的肾功能机能不全等，最后确定可接受的个体。目前没有发表确认的同行评审的替代生物标志物的推荐。男性和女性应被等同地描述，包括不同的种族和民族的混合。为确定第99 百分位数的个体数已经被IFCC TF-CB确定的最少为300名男性和300名女性。对所有当代灵敏的检测方法和/或hs-检测方法在相同参考或疾病人群中进行比较。2016年美国的国家AACC会议上，进行了一个参考区间血液采取研究，允许厂商购买535份血浆或血清样品，用于确定一个第99百分位数。

  

为解决检测间差异的难题，需要对已经在市场上用于临床实践的hs-cTn检测产品，进行当代检测产品的直接比较。在1研究中，检查了多个当代的、POC、和hs-检测产品，各个检测产品检测了低于第99百分位数检测浓度，范围从1%到98%的样品（图1）。在检测产品间的第99百分位数变异很明显，缺少cTnI和cTnI检测标准化的的对照示例。对所有或接近所有检测个体可检测浓度的hs-cTn检测方法，展现了心肌肌钙蛋白结果几乎为正态分布。

图1、第99百分位数值（蓝色圆点）和可检出浓度（红色方块）二者的比较，这是假设健康人群的样品，由19个心肌肌钙蛋白检测的检测结果的比较。比较时分为hs（在左侧）、灵敏的-当代（中间）、和POC（右侧）。为改良灵敏的。

 

hs-assay的分析含义（analyticaldesignation for hs-assay）

很重要的是要理解词语“高-灵敏度（high-sensitivity）”反映了检测特性，不是被检测的心肌肌钙蛋白形式上的差异。在确定为一个hs-assay应使用什么词语需要协同。词语“高-灵敏度”已经一致地被用于临床化学杂志，更经常地在整个学科/医学文献中。这个词语。但是，有一大堆问题：你如何确定某个hs-检测？IFCC TF-CB已经提议要确定某个检测为hs，必须符合2个分析指标。

首先，在第99 百分位数值的% CV应≤ 10%。第二，可检出的浓度应对至少50%的健康个体达到的浓度高于检测方法的LoD。正如表2 和图1所示，当使用IFCC推荐时有可检出浓度推荐率，hs-检测方法显示了低于该推荐率。近期被FDA批准的检测方法，无论是当代的还是POC的，没有一个符合一个hs设定的2个分析指标。一个市售的hs-cTnI检测全球可用（除了美国，还没有得到FDA批准）。对hs-检测，所有杂志、厂商、和实验室，使用当代的和POC检测时，应采纳ng/L为检测计量单位，避免混淆和不必要的零小数点。这样，浓度为0.0015 μg/L（当代检测）需要报告为2 ng/L（hs-检测）。

 

性别派生的第99百分位数（Sex-Derived 99th Percentiles）

对于hs-cTn检测，推荐了性别特定的第99百分位数。多个研究已经展示了按照性别的明显不同的第99百分位数，男性具有较女性较高的浓度，因男性具有较女性较大的左心室质量，因此需要性别不同的第99百分位数。在一个大型的健康人群队列研究中，使用5个hs-检测方法检测hs-cTn，男性较女性具有较高比例的可检出的心肌肌钙蛋白浓度（表3）。hs-cTnI检测展示了对检测值高于LoD的一个多样化能力，但是所有大于50%。在检测间对女性不可检出的心肌肌钙蛋白值变异很大，与男性相比具有较高比例的不可检出值。通过使用hs-cTnT检测，观察到在男性与女性间，在可检出值的比例（F，7%与M，43%）和不可检出值比例（F，93%与M，57%）上有显著差异。

  

从一个临床预期上，这些数据是多信息的，由于目前在使用单次检测不可检出的心肌肌钙蛋白值去排除AMI的紧急要求，如果在LoD以下，安全地确认了一个亚组患者处于不利事件的非常低风险。一个平衡需要对尽可能最高比例患者使用排除做法，和使用高分析灵敏度的检测的兴趣间的撞击，促使使用以后的系列浓度改变，特别在低浓度，去确认/排除急性MI。而且，它必须理解，不同的检测将具有不同的LoD浓度。

确定第99百分位数值的统计方法（Statistical Approach toDefine 99th Percentile）

需要有一个统一的标准化的统计方法去计算心肌肌钙蛋白第99百分位数。近期发表的研究是首先展现和支持使用非参数方法和非Harrell-Davis 引导程序（Bootstrap）方法（或非参数引导程序方法）或Robust（稳健）方法。非参数方法是一个没有分布（或分布自由）的方法，使用观察值的等级来确定百分位数，给出参考区间/判断限。计算很简单，并容易确定某个抽样大小。对于第99百分位数和90% CI，要求n ≥ 299的研究参加者，这是作为IFCC TF-CB推荐的。Harrell-Davis引导程序方法使用了一个顺序统计量的线性组合，去估计一个百分位数/参考区间，并使用不完全的β分布加权观察值。但是，它涉及了较复杂的计算。它可提供由转换的非参数方法得到类似的结果，但过多的努力看来不是值得做的。这个方法也可被离群点有较大影响。稳健方法使用了位置和大小（location and scale）的估计、反复加权-观察值、和平滑/下降-加权观察，它使离群/极值观察值影响最小，要求数据是对称的，和计算上是集中的。

 

hs-cTn检测的生物变异（Biological Variability ofhs-cTn Assays）

在临床实践的今天，对cTnI和cTnT二者的当代的和POC的检测，确定生物变异是不可能的，因为这些检测对健康个体可靠地检出浓度，只有＜25%的健康个体可以检出值。相反，表3展示了5个hs-检测方法的生物变异特性。个体内平均心肌肌钙蛋白浓度对cTnI和cTnT分别在2ng/L和5ng/L，参考改变值（RCV）范围从±32%到±69.3%。也已经发现相同检测在不同分析仪上hs-cTnT在RCV上的差异。

 

使用临床指标确定hs-检测方法（Characterizing hs-Assays byUsing Clinicla Criteria）

IFCC TF-CB提供了确定hs-cTn检测的分析特性指标，研究者已经以为，临床指标也在确定hs-检测方法中很重要。IFCC TF-CB近期正在评价是否下列临床指标可提供hs-检测方法的清晰度。首先，使用一个排除MI指标，这是hs-cTn检测＜LoD浓度确定的，与基础样品处的NPV＞99.0%、和临床灵敏度在基础样品处＞99.0%是一致的。第二，使用一个风险后果指标，这是以30天内重大不利心脏事件或所有原因的死亡的NPV＞99.0%，使用某浓度＜LoD、或一个0-1h或0-2h的绝对浓度Δ（取决于检测方法）确定的。将需要外加的研究，以确定是否这些风险指标也可用于当代检测方法。

 

实施心肌肌钙蛋白Δ(检测结果间差异）值（ImplementingΔCardiacTroponin Values）

作为最佳的临床特异性，对于cTnI或cTnT值没有统一的Δ值。Δ将依赖于检测方法，与hs-检测的绝对浓度改变相比，当代的和POC检测的百分改变间不同。另外，计算Δ值将极其取决于系列样品间的时间点，即，0-1、2或3h（hs-检测方法）与0到6h（当代的检测方法），以及初次心肌肌钙蛋白浓度是否在参考范围之内低于第99百分位数（在疾病进展的时间）、或高于第99百分位数。很小浓度的改变也会因当代的和POC检测很差的分析不精密度，在低心肌肌钙蛋白浓度处具有趋向很差的不精密度，特别是接近第99百分位数的那些检测结果。如果不同的检测方法可比较下，确定分析时间的一致阶段，对于形成一个这个分析的准确方法也很重要。应形成了一个推荐，对于hs-cTnT使用50%改变接近第99百分位数的URL，20%改变则在3小时内，基础值被增加高于第99百分位数。缩短时间区间（≤3 h）将要求hs-cTn检测方法参与排除AMI。对较晚呈现MI的必须经常给予考虑，否则会混淆了使用绝对的和百分的Δ值。

 

准备实施hs-检测方法（Preparing for Implementation ofhs-Assays）

由于发生了全球的改变，实验室需要开始准备他们的服务，用好hs-检测方法。以下起草的检查清单，来自以证据为基础的文献导出的，将帮助教育近期使用hs-检测方法的实验室、和在准备使用还未开始使用hs-检测方法的实验室，协助他们从当代的和POC检测方法转换为hs-检测方法。首先，教育对检验医学和临床人员进行属于实施的厂商检测的有关文献的学习是必要的。将分析的、诊断的和风险评估的后果研究的分类给你的临床同事，以及在他们讨论会议和临床会议上给予新的hs-检测方法的现有信息。第二，形成新的hs-检测方法用户间的理解，如浓度数将改变、和他们不要预期有转换因子。第三，按照IFCCTK-LB教育资料，将需要建立在第99 百分位数处的URL。第四，将准备需要改变单一的到性别特定的第99百分位数URL，认识这个值对女性将低于男性的。第五，报告仅为完整整数，以ng/L表达。第六，确定控制物质处于第99百分位数，以监视%CV。第七，考虑使用hs-检测方法的心肌肌钙蛋白值＜LoD作为一个潜在的排除特征。与你的急诊医师紧密合作，以揭示这个经济节约的利用。第八，提供系列检测方案，考虑较早的检测，如在基础（0时）、1.5h和3h，作为诊断测定。与急诊部的医师和心脏病专家联合工作，确定临床方案，以促进最佳时间。第九，教育你的临床医生，尽管一个升高的心肌肌钙蛋白是MI的反映，但它确实不是说就是一个MI，由于每个患者的心血管病史必须在这个情况下审核。第十，确保良好的分析前取样的工作，由于hs-检测方法是那样的灵敏，很差的样品质量会是问题。

 

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