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定量质谱研究食管癌细胞异常蛋白表达和修饰

tjsepuweixin 2020-05-26 15:37:16

郭振昌,翟贵金,田姗姗,张锴*

(天津医科大学天津市医学表观遗传学重点实验室,天津,300070

摘要:采用稳定同位素标记氨基酸代谢技术(SILAC)、抗体亲和富集和质谱鉴定,分析了食管癌细胞和正常食管上皮细胞在蛋白质组、赖氨酸乙酰化、琥珀酰化及磷酸化修饰等方面的差异,并研究蛋白和修饰异常表达的分子网络。

关键词:蛋白质组学,翻译后修饰,高相液相色谱-质谱联用技术,食管癌

食管癌是我国高发的致死癌症之一,只有不到10%的食管癌病人存活期可以超过五年。目前的研究认为食管癌患者存活率较低,这与食管癌细胞具有较高的侵袭和转移能力有关,然而其肿瘤分子机理尚不十分明确。因此食管癌蛋白分子网络的鉴定,特别是异常表达蛋白的深度分析,对揭示食管癌的机制具有十分重要的意义。

1实验部分:

1.1 仪器与试剂:

超高压液相色谱-四极杆/静电场轨道阱质谱仪(QE,美国Thermo-fisher公司),乙腈、水和甲酸(色谱纯,德国Merck公司)。

2. 结果与讨论

2.1研究策略、方法及应用

定量蛋白质组学技术已成为当前大规模蛋白质鉴定的重要手段。本研究以高侵袭性的食管癌细胞SHEEC和食管上皮细胞SHEE为目标,分别采用轻、重稳定同位素进行细胞蛋白氨基酸标记(SILAC),通过多维液相色谱分离结合高分辨质谱,鉴定了两种细胞蛋白质组。共鉴定了7000多个蛋白质,并对其中3000多个蛋白质进行了定量分析。采用多种生物信息学工具,进一步对差异性蛋白进行了分析,研究了食管癌和上皮细胞表达差异性的蛋白分布规律、分子网络和通路。

赖氨酸乙酰化修饰是近年来备受关注的蛋白修饰形式,对细胞的基因转录和能量代谢具有十分重要的调节功能[1-2]。已有的研究表明:关键蛋白赖氨酸修饰的失调与肿瘤的发生和发展密切联系,是肿瘤治疗的潜在靶点。我们在食管癌细胞SHEEC和食管上皮细胞SHEE白组定量的基础上,将液相色谱分离与赖氨酸乙酰化抗体亲和富集相结合,联合LC/MS/MS分析,鉴定了800多个乙酰化位点,分析了食管癌细胞和食管上皮细胞赖氨酸乙酰化修饰的图谱,考察了食管癌SHEEC细胞赖氨酸乙酰化蛋白的分布规律、结构特性、分子网络和通路。通过定量分析,发现了SHEEC中异常表达的赖氨酸修饰蛋白和位点。

3 结论

利用多种生物信息学工具对SHEECSHEE的蛋白质组和赖氨酸乙酰化修饰组进行了系统分析和定量的比较,研究了食管癌SHEEC细胞表达的赖氨酸乙酰化位点、作用底物蛋白和特定修饰酶的关联和网络。差异性蛋白定量分析结果进一步提示:食管癌SHEEC细胞表达显著升高的一些蛋白已被证实与肿瘤的发展具有联系,但仍有一部分差异性表达蛋白与肿瘤的关系尚不清楚,因此这一研究的开展有利于食管癌分子机制研究和潜在抗肿瘤药物靶点的发现。

参考文献:

[1] C Choudhary, C Kumar, F Gnad, F. et.al. Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions. Science (2009) 325, 834−40.

[2] K Zhang*, S Zheng, JS Yang, et. al. Comprehensive Profiling of Protein Lysine Acetylation in Escherichia coli. Journal of Proteome Research, (2013) 12, 844-851.

 

1:食管癌细胞和食管上皮细胞蛋白质组的质谱定量分析

 Fig. 1: Quantitative analysis of proteomics (SHEEC/SHEE)

 

2:食管癌细胞中赖氨酸乙酰化、琥珀酰化和磷酸化的关联

Fig. 2: Relationship among lysine acetylated proteins, lysine succinylated proteins and phosphorylated proteins

Comprehensive Profiling of Proteins in Human Esophageal Carcinoma Cell

Guo Zhenchang, Zhai Guijin, Tian Shanshan, Zhang Kai*

 (Tianjin Key Laboratory of Medical Epigenetics, Tianjin Medical University, Tianjin 300070

Abstract:Esophageal cancer (EC) is the sixth leading cause of cancer deaths worldwide. However the molecular mechanism is not yet known. Herein we used the mass spectrometry based proteomics coupled with stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) and protein modifications enrichment approach to characterize and post-translational modifications (PTMs) in human esophageal carcinoma cell and esophageal epithelial cell. The differential expression of acetylated proteins was further characterized and compared with expression of proteomics, lysine succinylation, phosphorylation, as well as the correlation of protein acetylation and SHEEC occurrence.

Keywords: Proteomics, Post-translational modifications, HPLC-MS, Esophageal cancer