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iTRAQ定量蛋白质组揭示整合素α5促进人牙周膜干细胞的成骨分化

Priming integrin alpha 5 promotes the osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells due to cytoskeleton and cell cycle changes

研究对象：人牙周膜干细胞

发表期刊：Journal of Proteomics

影响因子：3.914

发表单位: 南方医科大学

作       者：吴补领（通讯），王贺（一作）

发表时间：2018 年3 月

关 键  词：细胞分化，整合素α5，骨生成，牙周膜，蛋白质组学，干细胞

牙周炎是一种非常普遍的口腔疾病，会对牙周膜（PDL）以及牙齿功能造成损害。目前较有前景的牙周炎治疗方法是利用牙周膜干细胞（PDLSCs）进行PDL再生，然而PDLSCs成骨分化的机制尚未完全阐明。本研究基于iTRAQ定量蛋白质组学技术，旨在探究整合素α5（ITGA5）在PDLSCs中的作用机制，以期找到调节牙周组织再生的靶标。

1. 在体内外ITGA对PDLSCs的作用

Western blot结果显示成骨诱导组（OM）的ITGA5表达水平随时间升高，慢病毒转染ITGA5i（ITGA5i-LV）后明显抑制了ITGA5表达，转染ITGA5（ITGA5-LV）则增强其表达（图1A），合成环肽（SCP）也可极大提高PDLSCs中的ITGA5表达水平（图1B）。细胞增殖实验CCK8（图1C）、细胞周期实验（图1D）以及细胞迁移实验transwell（图1E、F）也得到了同样的结论，ITGA5i抑制PDLSCs的增殖、迁移能力，而ITGA5和SCP则增强PDLSCs的增殖、迁移能力。磷酸化的FAK、PI3K/AKT以及MEK1/2和ERK1/2在PDLSCs的成骨分化过程中发挥着关键作用（图G）。另外，碱性磷酸酶（ALP）活性检测、茜素红染色结果显示OM诱导促进了PDLSCs的矿化，OM+ITGA5i-LV抑制矿化，OM+ITGA5-LV/SCP则增强矿化，SCP效果更佳（图H）。

通过裸鼠皮下移植PDLSCs细胞和羟磷灰石/β-3-磷酸钙（HA /β-TCP）复合物进行体内的骨生成实验，结果显示，ITGA5-LV增强了骨样和牙周膜样（PDL-like）组织的形成，成骨标志物I型胶原（COL1）和骨连接素（ON）的IHC染色深度更强。

图1 ITGA对PDLSCs的作用（体外）

图2 ITGA对PDLSCs的作用（体内）

2. ITGA高表达的PDLSCs蛋白质组学分析

2.1 iTRAQ定量以及差异表达蛋白分析

，ITGA高表达组和对照组的差异表达蛋白共48个。与对照组相比，ITGA组有37个蛋白高表达，11个蛋白低表达。

图3差异表达蛋白热图及火山图

2.2 GO/KEGG功能富集分析

3488个蛋白有GO注释结果，其中39个差异表达蛋白进行GO富集，得到41个GO term，18个term属于BP，16个属于CC，7个属于MF。

2656个蛋白有KEGG注释结果，其中22个差异表达蛋白进行KEGG富集，得到6条KEGG通路，包括：酵母减数分裂、酵母细胞周期、卵母细胞减数分裂、孕激素介导的卵母细胞成熟、致心律失常性右室心肌病和细胞周期。

图4 GO富集功能分类

2.3 蛋白互作网络

利用 StringDB 蛋白质互作数据库进行鉴定蛋白的互作分析，得到30对互作蛋白。部分蛋白如KRT6B、PRPH、DES、KRT16进一步进行western blot以及免疫荧光验证，结果与蛋白质组学数据一致，在OM+SCP组KRT6B、KRT16高表达，PRPH、DES低表达。

图5 蛋白互作网络

图6 细胞骨架变化以及ITGA对PDLSCs的成骨机制

本研究基于蛋白质组学和生物信息学分析以及后续的生物学验证，发现了在成骨诱导的基础上通过慢病毒或合成环肽启动ITGA5可以介导PDLSCs的骨形成。FAK、PI3K/AKT、MEK1/2/ ERK1/2的磷酸化以及细胞骨架和细胞周期变化在成骨过程中发挥着重要作用。该研究表明，ITGA5人工结合环肽GA- CRRETAWAC-GA肽具有潜在的临床价值，可用于牙周膜的组织修复和再生，而细胞骨架蛋白如KRT6B、DES以作为PDLSCs分化过程的新标志物。