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心肌肌钙蛋白:分子的许多惊讶

检验医学 2018-12-05 16:18:06


冯仁丰


单克隆抗体是检测心肌肌钙蛋白T和I(相应的是cTnT和cTnI)的免疫检测基础,第一次报告是在约25年前。希望它们对急性心肌梗死(AMI)有更准确的诊断,因为改善了组织特异性。


在开始临床试验后,很快地认识到心肌特异性的优点;没有预料到在没有传统的AMI诊断指标的患者中,发生了“太早”升高的cTnT和cTnI;被初始相信理解为生物标志物的诊断特异性。进一步的临床研究确定了这些发现的真实原因:很小的心肌伤害。这些新的发现,使得cTn检测导致对心肌梗死的重新定义,最后为急性冠脉综合征(ACS)的新的临床诊断分类。


在新的诊断范例中,AMI是ACS的一个亚组,二者情况可由cTnT和cTnI升高是否高于预先决定的判断限值给出诊断。缺血性心肌损害诊断的未来演变,已经确认了7个类型的AMI,这在早期使用肌钙蛋白是没有预料的发展。

  

除了cTnI证实的心肌组织特异性和第二代cTnT检测改善的特异性外,生物标志物浓度的上升已经被发现在非缺血的心肌疾病,如肾衰和心衰,在心脏中毒的药物给予后、和在败血症和中风下。研究这些升高的原因,揭示了非缺血性心肌坏死作为cTn从损害的心肌细胞内释放的原因。它也已经被通过风险分层评估的过程确定,这些升高,无论是缺血性的还是非缺血性的,预示了更糟的临床后果,即使cTn浓度没有超过你预先设定的诊断判断限值。但与cTn的诊断角色相反,风险分层评估是一个统计过程,依据cTn和其他风险标志物浓度,证实一组患者和指定一个临床结果的某些可能性。

  

在引入到临床实践时,cTn检测被预期可简化AMI的诊断,但是它看来,它是临床诊断的一个打开的潘多(Pandora)拉魔盒。尽管cTn使得诊断AMI在消除了因非特异原因的复杂性后有点简单,但准确解释cTn浓度依然要求临床专家和实验室的专家。进一步复杂化了这个状态现状是,在临床实践中遇到了未预期的cTn结果时,必须考虑一系列分析变异。


其他的如cTnT mRNA 的拼接、cTnT和cTnI二者转译后修饰的各个形式、循环的cTnT、cTnI和肌钙蛋白C(TnC)的单体、双聚体、或三聚体;cTnI的生理的磷酸化作用等,均已经在文献中报告,作为cTn结果和临床表现间不符的原因。循环抗-cTn自身抗体、封闭检测抗体的结合、和人抗鼠抗体(HAMA)等,会在肌钙蛋白检测中出现外加的分析干扰,导致假阴性和假阳性的肌钙蛋白结果。

  

2017年6月美国临床化学杂志上Katrukha等,研究了cTnT转译后修饰的另一种形式,是被凝血酶蛋白水解的降解,一个丝氨酸蛋白水解酶凝聚因子,会在缺血组织坏死处作用、或存在于收集血液后的人血清内。作者提供了通过凝血酶对cTnT蛋白水解的实验证据,可以在体外改变cTnT氨基酸序列。他们展现了在活跃的凝血酶存在下,cTnT分子的缩短;但可以被特定的凝血酶抑制剂封闭。


使用质谱分析,他们证实了一个29-kDa蛋白水解的碎片,被切的断裂位点在氨基酸第68和第69位置间,是一个精氨酸-丝氨酸序列,被考虑是凝血酶活性的特定位点。他们的发现与近期Streng等研究一致,他们展现了初步证据,隐含凝血酶是对cTnT降解的潜在物质之一。Katrukha和合作者延伸了这些研究,并提供了强烈的证据,凝血酶可切断cTnT,产生观察到的降解。

   

凝血酶不仅是一个蛋白水解的酶,也会是cTnT降解的主要作俑者。μ-钙蛋白酶(calpain)和半胱天冬蛋白酶(caspase),在cTnT的降解中起着一个活跃的角色,这是Di Lisa和其他展现的。尽管μ-钙蛋白酶和半胱天冬蛋白酶主要活跃在细胞内,在体内生理的影响;凝血酶解调的降解看来是细胞外的,大多在体外。它会发生在在梗死位点,但它也在血液收集管内的凝集中发生作用。


事实是,多个酶共同消化cTnT,可解释该事实,Katrukha和合作者在凝血酶抑制剂下不能完全预防cTnT的降解。他们的蛋白印迹分析也显示了在患者血清中存在着较小分子量的cTnT碎片;但不清楚的是,这些碎片是否来自被凝血酶切断的多肽的进一步消化、或它们来自完整cTnT分子,被其他非凝血酶的作用所致。原先的研究和这些小碎片产生的机制,不是近期文章的目标,但是它很值得以后去研究。

  

cTnT的蛋白水解消化不是独特的。cTnI也是在体内和体外二者的蛋白水解降解的一个目标。病原体的这样识别和导致改变cTn氨基酸序列,为实验室学科提供了重要信息。检测cTn浓度由免疫检测实施,依据被试剂抗体识别氨基酸短的序列,所以被称为决定簇。改变或丢失决定簇可减少或防止抗体的附着,导致假阴性实验室结果。

  

尽管这是免疫检测厂商的任务,去选择抗体与某个决定簇反应,不受酶降解的影响,临床医生使用检测结果,也必须懂得以往未被识别的决定簇的丧失有真正的可能性;明显假阴性结果时必须以另一个诊断程序进行检测。cTn大量的转译后消化也将使cTn检测标准化和一致性复杂化,由于各种抗体将被不同影响,因降解和存在开裂的序列。cTn的酶降解研究,会证实对临床实践很有用,在厂商血液收集管内含有酶抑制剂,预防了体外对肌钙蛋白的蛋白水解。

  

随着近期引入质谱分析到临床实验室,你可假设,免疫检测的干扰可以很快是过去的问题。但是,质谱分光分析也会要求用抗体进行免疫亲和提取或免疫沉淀,cTn浓度检测要求酶的消化,并由质谱分光对特定多肽序列的确认。丢失特征的多肽序列可来自体内或体外的蛋白水解,会阻碍对cTn浓度检测的准确度,即使是质谱分析。所以,cTn浓度的准确定量,要求理解和cTn分子的内部的和外部的心肌蛋白水解破碎。

  

本期临床化学杂志是一个提示,cTn检测不是一个静态的学科,cTn具有惊讶的特征,即使在活跃的使用25年后,它们依然对临床实验室展现新挑战。


来源:冯仁丰微信公众号







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