同时抑制MDM2和MDMX蛋白成为治疗白血病的新策略

                                           图文  |  于晓彧

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天择的第  11 期推送 ：治疗白血病的新策略

抑癌基因p53失活可导致多种肿瘤发生，在造血系统中，p53基因可督促DNA受损的细胞进入休眠或凋亡以避免肿瘤发生，因此，造血干细胞的p53失活常是白血病发生的原因。

急性白血病（Acute myeloid leukemia, AML）患者中，只有低于10%的患者发生了p53蛋白自身的突变，大多数患者是因为p53的抑制因子MDM2与MDMX的过高表达才罹患癌症。MDM2是内源的E3 泛素连接酶，可促进p53蛋白降解，MDMX可抑制p53的转录并促进MDM2的活性。

所以，MDM2与MDMX也是治疗肿瘤的重要靶点，现有MDM2的小分子抑制剂RG7112与RG7388正处于临床试验期，但这两个小分子都不能抑制MDMX。一种alpha螺旋的p53订书肽（pDI）可同时靶向MDM2与MDMX【1-5】，研究中使用的多肽药物ALRN-6924就是该订书肽的优化版，现已进入临床I期，有良好的抗肿瘤能力【6】。该研究主要探究了ALRN-6924在抑制AML中的机制与效果【7】。

首先，研究者验证了MDMX是AML的重要靶点并且ALRN-6924作用于MDMX与MDM2。相对于其它类型的肿瘤患者，AML患者体内的AML肿瘤细胞有异常的MDMX高表达，在分离出的AML患者造血干细胞与祖细胞中，MDMX的表达量也是高于健康人的。

为了检测ALRN-6924与MDMX、MDM2的结合常数，研究者设计了ALRN-6924、pDI与MDM2、MDMX的竞争性结合实验，证明ALRN-6924与pDI有相同的作用位点，且结合能力更强（ALRN-6924-MDM2-Kd = 33.6 nM，ALRN-6924-MDMX-Kd = 83 nM），与RG7388结合MDM2相比，ALRN-6924结合MDM2呈现了更好的动力学曲线。在多种细胞系中，ALRN-6924都可增强p21蛋白表达并激活Caspase 3/7，引发细胞周期停滞与细胞凋亡。

接着，研究者证明了ALRN-6924可激活CDKN1A(p21)基因位点的转录。在U2OS细胞系中将MS2-SL片段Knock in到CDKN1A 基因的3`UTR区域后，研究者获得了可用于RNA-FISH检测的活细胞呈像系统。利用该系统，研究者在单细胞水平，定量的观测到了ALRN-6924可持续10h激活p21基因位点的转录。这些结果说明ALRN-6924可迅速穿过细胞膜并可持续性影响p53依赖的信号通路。

随后，研究者检测了ALRN-6924影响p21位点转录后对p53通路的影响。向细胞中加入荧光标记的ALRN-6924 3h后，FACS可检测到细胞质、细胞核中存在ALRN-6924，证明了ALRN-6924的透膜性。ALRN-6924与MDM2-p53、MDMX-p53的Co-IP实验证明了ALRN-6924可影响MDM2-p53之间的结合与MDMX-p53之间的结合。取AML患者来源的AML细胞系，加入ALRN-6924后，Western Blot检测发现p53稳定性增强, p53下游的p21蛋白含量增加。

确定ALRN-6924对p53通路的影响后，研究者探究了ALRN-6924对AML细胞系生长能力与克隆形成能力（Colony-forming capacity，CFC）的影响。在五种p53 WT的AML细胞系中加入ALRN-6924，只有MDMX-FL/ MDMX-S（MDMX-S为MDMX-FL的Isoform，可降低有功能的MDMX的表达）比例较低的OCI/AML3细胞系反应较差，其余4种细胞系的生长能力、CFC明显减弱，细胞凋亡明显增加，并且在此实验中，ALRN-6924表现优于RG7388。利用shRNA敲低p53后，ALRN-6924的作用就消失了，再次明确ALRN-6924的靶点为MDM2与MDMX。

接下来，研究者测试了ALRN-6924对患者来源的AML细胞与小鼠嫁接肿瘤模型的作用。ALRN-6924可抑制AML患者的外周血细胞与骨髓细胞的CFC，还可很好的抑制AML细胞再次接种后的CFC，效果优于RG7388。在小鼠肿瘤嫁接模型中，BIW（twice per week）尾静脉注射ALRN-6924的小鼠与TIW（three times per week)注射的小鼠都表现出很好的肿瘤减少与生存期延长（图1）。同时，ALRN-6924对正常小鼠的造血细胞无显著影响。

图1

最后，研究者招募了一位20岁女性患者，该患者天生缺少一组p53基因，保留一组WT p53基因（p53 +/-），同时MDMX蛋白表达量过高，因此患有转移性乳腺癌与高危型骨髓增生异常综合征（MDS），并伴有白血病。体外检测发现ALRN-6924对患者MDS/AML细胞的增殖速度与CFC有很好的抑制作用。在体治疗数据表明，使用ALRN-6924后，患者的嗜中性白血球减少症由3级缓解至0级，3-4级的血小板减少症也消失了，可惜患者因转移性乳腺癌引发的全身性感染去世，无法继续接受治疗（图2）。

图2

临床实验结果表明，在治疗白血病中，ALRN-6924同时抑制MDMX与MDM2蛋白，有很好的治疗效果。

综上，本研究通过订书肽ALRN-6924，探究了MDM2、MDMX蛋白的分子机制与功能，为使用ALRN-6924治疗WT p53并高表达MDMX的白血病患者提供了证据。并且，分子机制得到阐释后，ALRN-6924也很有希望其它表达WT p53伴有高表达MDMX的各类癌种。

参考文献：

【1】F. Bernal, M. Wade, M. Godes, T. N. Davis, D. G. Whitehead, A. L. Kung, G. M. Wahl,L. D. Walensky, A stapled p53 helix overcomes HDMX-mediated suppression of p53. Cancer Cell 18, 411–422 (2010).

【2】Y. S. Chang, B. Graves, V. Guerlavais, C. Tovar, K. Packman, K. H. To, K. A. Olson, K. Kesavan, P. Gangurde, A. Mukherjee, T. Baker, K. Darlak, C. Elkin, Z. Filipovic, F. Z. Qureshi, H. Cai,P. Berry, E. Feyfant, X. E. Shi, J. Horstick, D. A. Annis, A. M. Manning, N. Fotouhi, H. Nash, L. T. Vassilev, T. K. Sawyer, Stapled –helical peptide drug development: A potent dual inhibitor of MDM2 and MDMX for p53-dependent cancer therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E3445–E3454 (2013).

【3】F. Bernal, A. F. Tyler, S. J. Korsmeyer, L. D. Walensky, G. L. Verdine, Reactivation of the p53 tumor suppressor pathway by a stapled p53 peptide. J. Am. Chem. Soc. 129, 2456–2457 (2007).

【4】B. X. Tan, C. J. Brown, F. J. Ferrer, T. Y. Yuen, S. T. Quah, B. H. Chan, A. E. Jansson, H. L. Teo, P. Nordlund, D. P. Lane, Assessing the efficacy of Mdm2/Mdm4-inhibiting stapled peptides using cellular thermal shift assays. Sci. Rep. 5, 12116 (2015).

【5】F. Wachter, A. M. Morgan, M. Godes, R. Mourtada, G. H. Bird, L. D. Walensky, Mechanistic validation of a clinical lead stapled peptide that reactivates p53 by dual HDM2 and HDMX targeting. Oncogene 36, 2184–2190 (2016).

【6】F. Funda Meric-Bernstam, M. S. Saleh, J. R. Infante, S. Goel, G. S. Falchook, G. Shapiro, K. Y. Chung, R. M. Conry, D. S. Hong, J. S. Wang, U. Steidl, L. D. Walensky, V. Guerlavais, M. Payton, D. A. Annis, M. Aivado, M. R. Patel, Phase I trial of a novel stapled peptide ALRN-6924-6924 disrupting MDMX- and MDM2- mediated inhibition of WT p53 in patients with solid tumors and lymphomas. J. Clin. Oncol. 35, 2505–2505 (2017).

【7】Luis A. Carvajal, Daniela Ben Neriah,Adrien Senecal, Lumie Benard,Victor Thiruthuvanathan,Tatyana Yatsenko,Swathi-Rao Narayanagari,Justin C. Wheat,Tihomira I. Todorova,Kelly Mitchell,Charles Kenworthy, Vincent Guerlavais,D. Allen Annis, Boris Bartholdy,1Britta Will, Jesus D. Anampa,Ioannis Mantzaris,Manuel Aivado, Robert H. Singer, Robert A. Coleman,Amit Verma, Ulrich Steidl, Dual inhibition of MDMX and MDM2 as a therapeutic strategy in leukemia. Sci Transl Med. 2018 Apr 11;10(436).