蛋白样品制备标准操作流程及裂解液的选择

  

一、制备细胞培养物裂解物

1. 将细胞培养皿置于冰上，用冰冷的 PBS 洗涤细胞。

2. 吸出 PBS，然后加入冰冷的裂解缓冲液（每 10⁷ 细胞/100 mm 培养皿/75cm² 培养瓶加入 1 ml；每 3×10⁶ 细胞/60 mm 培养皿/25 cm² 培养瓶加入 0.5 ml；每10⁶细胞/6孔板每孔加入0.2-0.3 ml）。

   注：根据实际操作经验，我们做了些优化，尤其是加入裂解液比较少的时候，如T75和T25培养瓶。步骤为：细胞PBS洗完后，可以先加入1-1.5ml的冰PBS，细胞刮刮下贴壁细胞，收集细胞悬液1500rpm，4℃离心5min，收集沉淀，再加入相应量的裂解液。

3. 用预冷的塑料细胞刮棒刮下贴壁细胞，然后轻轻地将细胞悬浮液转移至预冷的微量离心管中。

4. 在 4 ℃下持续搅拌 30 分钟或冰上孵育30min，期间可混匀几次。

5. 在 4 ℃ 预冷的离心机中以 16,000 × g 的转速离心 30 分钟。

6. 轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰上。将上清液转移至放置在冰上的新离心管中，弃去沉淀。

7. 样品可进行蛋白浓度测量或WB蛋白制样，蛋白保存于﹣20℃或﹣80℃。

 

二、制备组织裂解物

1. 用干净的（高压过的）工具切取目标组织，组织切成多个小块，每块约30mg，此操作最好在冰上进行，并且应尽快完成，以防止样品被蛋白酶降解。

2. 将组织置于圆底冻存管或 Eppendorf 管中，并浸入液氮中进行“速冻”。将样品保存在 -80 ℃下或液氮内以备后续使用，或放置在冰上直接进行匀浆。

3. 组织放在锡箔纸上称重，对于约 5 mg 的组织，向离心管中快速加入约 300μL 裂解缓冲液，然后用电动匀浆器或者玻璃研磨器进行匀浆，用另外 300μL 裂解缓冲液冲洗刀片两次，然后在 4 ℃下持续搅拌（例如，在回旋振荡器上）2 h，或冰上孵育1 -2h，期间混匀几次。

4. 4 ℃下在离心机中以 16,000 × g 离心 30 min。轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰上。将上清液转移至放置在冰上的新离心管中。弃去沉淀。

5. 样品可进行蛋白浓度测量或WB蛋白制样，蛋白保存于﹣20℃或﹣80℃。

 

蛋白质浓度测定

1.  进行 Bradford 分析、Lowry 分析或二喹啉甲酸 (BCA) 分析。通常使用牛血清蛋白 (BSA) 作为蛋白质标准品。

2.  确定每个样品的浓度之后，可将其冻存于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 以备后续使用，或以备进行免疫沉淀分析或以备凝胶上样。

注：由于蛋白浓度测定过程较繁琐且准确度较低，实际实验中我们一般不测量蛋白浓度，直接进行预实验，上样量均为10-15 ml，最后根据内参显影结果调整上样量。

常用裂解缓冲液及选择指南：

蛋白质位置及相应裂解缓冲液的选择

蛋白质位置	推荐缓冲液
全细胞	NP-40
细胞质（可溶）	Tris-HCl
细胞质（细胞骨架结合）	Tris-Triton
膜结合	NP-40 或 RIPA
细胞核	RIPA 或采用细胞核结构组分实验方案*
线粒体	RIPA 或采用线粒体结构组分实验方案*

*专门或主要存在于亚细胞结构位置的蛋白质在亚细胞结构组分裂解物中的富集程度高于全细胞或组织裂解物。这对于试图获取弱表达蛋白的信号非常有用。

Nonidet-P40 (NP40) 缓冲液

150 mM NaCl

1.0% NP40（可用 0.1% Triton X-100 替代）

50 mM Tris-HCl pH 8.0

蛋白酶抑制剂

NP40是研究细胞质蛋白、膜结合蛋白或全细胞提取物的常用一种缓冲液。如果担心目标蛋白不能从不溶材料或聚集体中完全提取出来，那么利用 RIPA 缓冲液更适合，因为其中所含的离子去垢剂更容易使蛋白质溶解。

 

RIPA 缓冲液（放射免疫沉淀试验缓冲液）

RIPA 缓冲液含有离子去垢剂脱氧胆酸钠作为活性成分，特别适用于破坏核膜提取细胞核内物质。RIPA 缓冲液产生的背景低，但可使激酶变性。它还能破坏蛋白质与蛋白质的相互作用，因此可能会给免疫沉淀分析和pull-down实验带来一些问题。

150 mM NaCl

1.0% NP-40 或 0.1% Triton X-100

0.5% 脱氧胆酸钠*

0.1% SDS（十二烷基硫酸钠）

50 mM Tris-HCl pH 8.0

蛋白酶抑制剂

*可制备成10% 脱氧胆酸钠母液（5 g 脱氧胆酸钠溶于 50 mL 溶液中）避光保存。

RIPA 缓冲液适用于全细胞提取物和膜结合蛋白，而且其提取细胞核蛋白的效果比仅含 NP-40 或 Triton X-100 的缓冲液的效果更好。但它会破坏蛋白质与蛋白质的相互作用，因此可能会给免疫沉淀分析和pull-down实验带来一些问题。

如需保护蛋白质与蛋白质的相互作用，或需最大限度避免蛋白质变性，应使用不含离子去垢剂（例如 SDS）的缓冲液，理想的缓冲液中还不应含有非离子去垢剂（例如 Triton X-100）。

使用不含去垢剂的缓冲液制备细胞裂解物时需进行机械剪切操作，通常利用 Dounce 匀浆器或使细胞通过注射器针头来完成此操作。这些情况下使用 Tris 缓冲液即可。如果要释放膜结合蛋白或细胞骨架结合蛋白，须使用含有去垢剂的缓冲液。

 

Tris-HCl 缓冲液

 20 mM Tris-HCl，pH 7.5

 

Tris-Triton 缓冲液（细胞骨架蛋白）

  10 mM Tris，pH 7.4

  100 mM NaCl

  1 mM EDTA

  1 mM EGTA

  1% Triton X-100

  10% 甘油

  0.1% SDS

  0.5% 脱氧胆酸盐

 

这些缓冲液可在 4 ℃ 下保存数周，或者以分装形式在 -20 ℃ 下保存长达 1 年。

 

蛋白酶和磷酸酶抑制剂

一旦样品开始裂解，蛋白水解、去磷酸化和变性也随即开始。始终将样品置于冰上或维持在 4 ℃ 下，并且一开始就向裂解缓冲液中加入合适的抑制剂，能够显著减缓这些反应。

许多供应商都提供即用型抑制剂混合物，一般选用罗氏的cocktail inhibitor药片或磷酸酶抑制剂，但您也可以自行制备抑制剂混合物。每个药片可配制成15ml或50ml的工作液，一般配制成25×的母液，分装保存在﹣20℃，使用前按比例加入裂解液中。

本文整理自abcam与丁香园并根据个人经验适当修改