基因检测
基因检测
2015年中国启动精准医学计划，拟在2030年前投入600亿元。2016年精准医学被列入“十三五规划”，在国家政策的推动下快速发展，并且涌现出一批优秀的创业公司。2017年上，多位代表提出基因检测相关议案，如将其纳入医保范畴等，进一步推动行业发展。基因测序作为精准医学的核心技术，其地位不言而喻。
基因检测作为朝阳行业，有多因素驱动其发展：（1）人口老龄化加剧及肿瘤发病率提高，基因测序的下游应用市场将继续增加；（2）科学研究不断投入与产出，更多的基因功能与疾病的关系将被揭示；（3）技术不断更新完善，测序成本不断降低，基因测序将被更多大众接受，进而加大数据分析的数据量，转而促进行业发展。
广义的基因检测方法包括一代测序，质谱，芯片，PCR，二代测序等多种方法，由于一代测序和质谱检测已基本不再应用于临床检测，也缺乏相应的对标企业，本文将系统介绍和分析当下基因检测的主要方法——二代测序和PCR这两个细分行业发展情况及可能的投资机会。
定义
基因是DNA中能够编码蛋白质的核酸序列，而基因检测则是通过不同的技术路线的方法确定全部或部分DNA序列的过程。
基因检测的主要对象包括：单个位点（碱基）的检测、即单核苷酸多态性（SNP），插入或缺失突变（InDel (Insertion/Deletion)，DNA序列中插入/缺失一个或多个核苷酸），序列片段的拷贝数变异（Copy Number Variant, CNV），序列的结构变异（Structure Variant，SV）等。目前最主要的检测突变类型是单核苷酸多态性（SNV）、插入或缺失突变（InDel）和拷贝数变异（CNV）。
基本方法
①Sanger测序
Sanger法，又称双脱氧末端终止法、一代测序，以其发明人英国生物化学家Frederick Sanger命名。是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见DNA碱基序列的一种方法。
其特点在于，检测对象必须是单一组分，若部分位点存在SNP，突变频率在20%以下的很难被稳定检出。
目前最为常用的为AppliedBiosystems（ABI）公司的3730XL测序仪，该型号测序仪测序有效读长可以到达800到1000bp，单碱基准确性高。可同时分析96个样品，采用4色荧光同时检测，可不间断24h运行，自动灌胶，上样，电泳分离，检测及数据分析。可进行多种片段分析，包括微卫星DNA分析，比较基因型分析，单核苷酸多态性（SNP）研究等。
在临床操作中，如果想要检测某一位点/片段的情况，需要在提取DNA后先通过PCR扩增出待检测区域，再上机测序。如果为了确定SNP或某种DNA是否存在，效率不及PCR。但如需进行有限数量的片段分析，则为首选方法，例如，目前较为火热的PD-1单抗适用对象为具有微卫星不稳定（MSI）的患者，而MSI检测的首选方法即为基于Sanger测序的毛细管电泳法。
②质谱
生物质谱,有别于传统质谱,测定的对象是分子量可高达几万至几十万的生物分子,这使得传统的电子轰击(EI)、化学电离(CI)等电离技术的应用受到了极大的限制。随着快原子轰击(FAB)、MALDI、ESI 、离喷雾(IS)、大气压下碰撞电离(APCI)等电离技术的出现,大大提高了质谱的测定范围。特别是ESI/MS和MALDI/MS显示了在生物大分子分析(如蛋白质和核酸)上的巨大潜力。
目前,质谱DNA测定通常采用以下3种策略:(1)梯度测序;(2)Sanger产物的质量分析;(3)气相裂解测序。
梯度测序是用DNA外切酶来连续地断裂核苷酸链,根据相应质量变化来确定碱基组成。梯度测序所需的质量分辨率和准确度要远比Sanger测序严格。在梯度测序中,为区分A和T,必须测出9道尔顿的质量差异。然而在Sanger测序中只要测定出300道尔顿的质量差异就已足以确定顺序。酶消解的费时以及该方法对仪器的高要求使得该方法面临诸多困难。
Sanger产物质量分析是寡聚核苷酸序列测定的最直接的办法,只是用质谱替代凝胶电泳。与凝胶电泳比较,质谱具有潜在的时间和费用优势:传统的凝胶分离可能需要几小时,而质谱测定常常可以在一分钟内完成。
气相裂解法是通过亚稳态或碰撞诱导解离的碎片离子的质量分析来完成测序。气相裂解测序的优点是比那些依赖于溶剂相化学的方法快得多。但是它的缺点也很明显:碎片谱很复杂,难以解释。对质量分辨率和质量测定准确度的要求要等于或高于梯度测序。
AgenaBioscience(原Sequenom Bioscience)公司MassARRAY 核酸质谱技术平台的临床应用版“IMPACT Dx™系统”于2014年6月16日获得美国FDA认证可用于临床分子诊断应用，从而成为世界上第一台，也是唯一一台获得FDA临床认证的核酸质谱平台。Agena Bioscience公司于2014年5月30日收购了Sequenom公司的生命科学部。
③基因芯片
基因芯片(GeneChip)（又称DNA芯片、生物芯片）又称DNA微阵列(DNA microarray)，其原型是80年代中期提出的。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针，当溶液中带有荧光标记的核酸序列与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。
基因芯片的优势在于可以在一张芯片上都是检测多个靶基因，效率较高，但其灵敏度和特异性偏低的问题也极大的限制了其在临床上的应用。
2014年1月17日，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了Affymetrix公司的CytoScan Dx Assay，该检测用于检测染色体的变异，这种变异可能与儿童的发育迟缓或智力残疾有关。基于血液样品，该测试可以一次试验就检测出整个基因组的染色体大片段及小片段的缺失及扩增。
在我国，博奥生物以基因芯片起家，其耳聋基因检测芯片2009年获FDA批准，市场占有率达50%以上。
④ PCR
广义的基因检测包含部分PCR方法，即通过PCR确定某位点等位基因情况（PCR作为分子诊断的另一应用为检测某一段DNA的有无，如乙肝病毒载量检测等）。荧光定量PCR和数字PCR均可用于此用途。后文将有详细论述。
⑤二代测序
二代测序区别于一代测序主要在于，可以一次检测复杂组分中每段DNA的序列，且通量更高。该技术一经推出，对科研和临床产生了重大的影响，成为产业和资本竞相追逐的对象。
由于Sanger测序，DNA质谱检测和基因芯片方法均较为成熟，已经几乎与投资领域无关，本文将着重就PCR与二代测序进行介绍分析。
基因编辑
基本原理
基因编辑（GeneEditing）包含多种方法，如ZFN，TALEN和CRISPR/Cas9等。ZFN和TALEN并非目前投资领域关注的重点，这里不作详细介绍，主要介绍CRISPR/Cas9的相关内容。
成簇规律间隔短回文重复序列系统技术（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats /CRISPRassociated proteins）为继ZFN，TALEN之后的第三代基因编辑技术，靶向效率更高。操作简单，构建成本低，编辑效率高。目前，CRISPR/Cas9系统几乎可实现对任何基因的编辑。
如图所示，5'端为tracrRNA基因，中间为Cas9蛋白编码基因，3'端为CRISPR基因。Cas9蛋白的N断和中部有发挥切割活性的功能结构域；CRISPR基因包括前导序列（leader）、间隔序列（protospacers）和重复序列（directrepeats）。Cas9蛋白含有RuvC和HNH两个活性位点。HNH负责与crRNA互补链的切割，切割位点多数在PAM上游第3个碱基外侧。RuvC负责非互补链的切割，切割位点在PAM上游的3~8碱基之间。若将Cas9两个活性位点之一（D10A或H840A）突变便只能切割单链。
潜在应用领域及相关企业
模式生物和细胞系的构建
从这一技术发现之初，就用于细胞系和动物内基因敲除、插入模型的构建，极大的提高了构建效率。
模式生物（839728），百奥塞图，吉凯基因，易锦生物等均在应用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除细胞系和小鼠的构建。
功能基因组学与药物筛选
2014年，Feng Zhang，George Church和北京大学魏文胜团队先后在Science，Nature上报道了CRISPR/Cas9文库在功能基因组学中的应用。简单地说，可以快速构建细胞系，该细胞系中不同细胞内不同基因被敲除，如细胞系足够庞大，可覆盖整个基因组，从而可以使用这一细胞系进行功能基因或药物的筛选。
博雅辑因专注于利用CRISPR/Cas9文库提供功能基因组学研究及药物筛选服务，为Bayer等国际知名药企提供服务，该公司曾获IDG等基金投资。
单基因疾病
部分单基因疾病，可利用腺病毒/慢病毒等载体运输Cas9与sgRNA进入患病部位细胞，修正引起基因的基因变异。
例如，杜氏肌营养不良是一种X染色体隐性遗传疾病，主要发生于男孩，这种疾病编码抗肌萎缩蛋白的基因缺陷，抗肌萎缩蛋白是维持肌肉纤维强度的必需分子。缺乏这种蛋白，肌肉和心脏肌肉会发生退化。杜氏肌肉营养不良症患者的典型病例会先失去行走能力，依靠轮椅生活，然后失去呼吸功能，依靠呼吸生存，大约在25岁左右死亡。2015年12月，Science杂志的三篇文章利用CRISPR/Cas9技术在该疾病的治疗上取得了一定突破。
德克萨斯大学西南医学中心EricOlson小组使用腺病毒将携带编码CRISPR引导RNA和Cas9序列导入小鼠肌肉细胞内，这一CRISPR能切除肌肉细胞的错误外显子。治疗时采用直接肌肉注射或静脉注射的方法将携带CRISPR系统的病毒，使肌肉细胞能表达出小分子抗肌萎缩蛋白，治疗后动物肌肉强度明显增强。
杜克大学生物医学工程学者CharlesGersbach和哈佛大学干细胞学家Amy Wagers分别和哈佛和MIT学者CRISPR专家张锋合作完成，并分别报道了他们类似的研究结果。CRISPR的精确性也在研究中进行了评价，所有三组研究都没有发现这种技术因脱靶效应影响到其他基因。Wagers小组发现，在肌肉干细胞内的抗肌萎缩蛋白缺陷基因也受到修复，这一结果说明这种治疗不会随着这些成熟肌肉细胞的退化效果消失。大约80%的杜氏肌肉营养不良症患者将可能因为这种技术受益，但是开展临床研究仍需要等待数年。进入临床前需要进行大型动物实验，证明这种技术的安全性。
2016年美国哥伦比亚大学和爱荷华大学的科学家们近期通过应用CRISPR / Cas9基因编辑技术诱导疾病患者多能干细胞分化的方式在小鼠中实现了眼疾色素性视网膜炎相关缺陷基因的修复。
癌症治疗
2016年6月，美国NIH下属Recombinant DNA AdvisoryCommittee批准的将由CAR-T大牛Carl June教授领导的一项CRISPR临床试验。在该试验中，研究人员将利用Cas9在黑色素瘤靶向的CAR-T细胞中敲除编码PD-1的基因以及内源性T细胞受体的基因。Carl June教授2016年11月在Clinical Cancer Research杂志上发表一篇论文证实，体外和动物模型研究中，CRISPR基因编辑CAR-T细胞表现出了强有力的抗肿瘤活性。TCR和I类HLA双重缺陷的T细胞同种异体反应性（alloreactivity）降低，且没有导致GVHD。此外，同时三重基因组编辑（增加了对PD-1基因的编辑）增强了CAR-T细胞的体内抗肿瘤活性。
2016年7月，四川大学华西医院卢铀教授申请的CRISPR人体临床实验已经获得了华西医院审查委员会的伦理批准，将利用CRISPR技术敲除T细胞中的PD-1并灌注回人体，以观察改造后的T细胞对化疗、放疗以及其它疗法治疗无效的转移性非小细胞肺癌患者的效果。
感染性疾病治疗
2016年6月30日发表在PLoS Pathogens的一篇文章报道，来自荷兰乌德勒支大学医学中心的Robert Jan Lebbink和同事们认为CRISPR/Cas9xitong 应当能够靶向作用于被感染的人细胞中的潜伏性疱疹病毒DNA并让它们的DNA发生突变，因而潜在地阻止疱疹病毒相关的疾病。为了测试这一点，他们设计出与疱疹病毒基因组特异性结合的gRNA，研究了三种不同的疱疹病毒成员：导致唇疱疹和疱疹性角膜炎的1型单纯疱疹病毒（HSV-1），人巨细胞病毒（HCMV）和导致传染性单核细胞增多症和多种癌症类型的爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr virus, EBV, 也被称作EB病毒）。结果表明：该系统可以将EBV从被潜伏感染的肿瘤细胞中高度有效地和特异性地清除出来，以及破坏HSV-1和HCMV在人细胞中的复制。
2016年5月，Temple University的Kamel Khalili博士在Gene Therapy杂志发表文章，报道了其科研小组利用CRISPR/Cas9系统能高效地应用于两种小型模式动物的很多器官中，而且能够将HIV病毒DNA的较大片段从宿主细胞基因组中切除。
器官移植
2017年10月，Science报道了杨璐菡团队（eGenesis）基因编辑技术和小分子药物在猪的原代纤维细胞中实现了25个基因位点的同时打靶，即在猪基因组中去除内源性逆转录病毒，实现了异种器官移植的第一步。
国际主要基因编辑企业
EditasMedicine
由Zhang Feng创立于2013年11月，主要利用CRISPR/Cas9技术进行原因明确的遗传病的治疗，其产品管线如图所示。
其中进展最为顺利的是一种叫做10型莱伯氏先天性黑矇症（一种遗传性视网膜病变，出生时或出生后一年内双眼锥杆细胞功能完全丧失，导致婴幼儿先天性失明；发病率约为1/100000），这种病无论亚洲还是欧美都没有正在进行临床试验的治疗方式。利用CRISPR/Cas9系统，Editas已经成功在细胞系中修复了造成黑矇症的突变基因，修复后的基因表达正常。
投资逻辑
基因编辑尚处技术研发早期，脱靶效应（off-target）等问题尚未完全解决。其科研应用相对成熟但市场有效，临床应用想象空间大但并非可以一蹴而就，预计需要相当长的一段时间来完善技术以做好进入临床的准备。
潜在标的
（1）博雅辑因
博雅辑因（北京）生物科技有限公司（EdiGene Inc.）是中国首家专注于基因组编辑的生物高科技公司。EdiGene拥有高效基因组编辑技术、先进的高通量遗传筛选平台以及健全的基因敲除细胞文库，致力于为疾病患者、医药及诊断企业、基础科研提供多种产品和服务。同时博雅辑因联合医药企业和医疗同行，合作开发针对癌症、遗传疾病及感染性疾病的新型治疗方法。
博雅辑因的科研团队来自于北京大学、斯坦福大学、康内尔大学等多所知名院校，拥有基因组编辑技术、高通量筛选和疾病研究相关的丰富经验，发表了包括《Nature》、《Nature Biotechnology》、《Cell Research》等众多学术论文，拥有大量专利成果。
（2）合生基因
合生基因致力于为全球生命科学研究者提供世界一流的个性化合成生物学技术服务与科研产品。合生基因布局合成生物学全产业链，推出包括生物试剂（BioGeekTM）、基因元件共享（GE ShareTM）、高端科研服务（SyngenTech®）、临床医学（SyngenCareTM）等不同层次的产品与服务。
基因检测和基因编辑作为基因组学研究的两种有效手段，近年来不仅在技术上有了重大突破和长足进展，同样也吸引资本的关注和投入。
然而，基因检测行业在2014-2016年的迅速发展中堆积了一定的泡沫，也初步形成稳定的市场格局和企业定位——华大基因、贝瑞和康等龙头企业已登陆A股，安诺优达、诺禾致源也有上市计划，但一众中小企业发展尚需资本助力，发展较为缓慢，庞大的资本热闹与有限的市场空间形成了鲜明的对比。笔者认为，在投资中，行业龙头和具有成长空间的细分行业龙头值得投资，具有创新技术的新企业同样具有投资价值，但那些技术创新性不高，产品雷同的企业发展空间将十分有限。
基因编辑是继基因检测之后又一热点，作为该领域的曾经的科研人员，笔者认为，其科研空间虽有，但很多实验室可以自行摸索完成，科研服务空间不大，临床应用有着十分美好的远景但并非可以一蹴而就。可以适当选择科研基础扎实，临床结合紧密，市场意识和公司运营能力强的团队进行早期和长期布局。
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