前言 桑叶有极高的营养价值和药用价值，现代科学研究表明：桑树叶中含有多种黄酮类成分、生物碱、氨基酸、多糖等其他活性成分。本实验对桑叶中多种活性物质的测定方法进行了研究，选择了适合桑叶条件的测定方法。 目前对于桑叶中总黄酮的含量测定方法主要有高效液相色谱法、紫外分光光度法等。本实验曾经设计采川高效液相法，由于需要多种黄酮标准品，难以同时测定桑叶中的多种黄酮含量，2000年版紫外分光光度法测定槐米巾芦丁含晕的方法进行实验研究。并改煎煮法、索 氏提取法为回流法提取法，对桑叶中的总黄酮含量以芦丁计算。杨贵明等利用分光光度法测定不同采集期桑叶中总黄酬的含黾，桑叶总黄酮的含量十月份最高， 常用的多糖含量测定力’法为比色法，有蒽喇硫酸法和苯酚硫酸法；本文采用苯酚一硫酸比色法测定桑叶多糖，改进了桑叶多糖的除色技术， 使用活性炭脱色，本法简单，显色稳定，灵敏度高，重现性好。孙莲等对不同采收期的桑叶多糖含晕测定，桑Ht-,总多糖的含量十月份最高，达至JJ57．4％。 有关桑叶中DNJ 1．脱氧野尻霉素 含鼍测定方法的报道有：柱前衍生化． 高效液相色谱荧光检测法，柱fj仃衍生化一高效液相色谱紫外检测法，离子色谱法， 了六羟基生物碱，其中包括从桑叶组织中得到的DNJ。本文采用柱前衍生化． 高效液相色谱紫外检测，灵敏度虽稍低于荧光检测，但经过改进衍生化反应体系中试剂的加入量，反应产物经RP—HPLC分离后，DNJ．FMOC完全能够用紫外检测器检测，更为重要的是由于～般高效液相色谱仪上均配备紫外检测器，所以本测定方法更易于推广普及，具有更大的实用性。另外，对不同采收期桑叶中的DNJ含量暂时没有报道。 关于GABA 丫．氨基丁酸 的测定方法，近年来国内外有氨基酸分析仪测定、酶法、色质联用法、柱层析荧光测定法、纸电泳比色、毛细管气相色谱法、放射性受体法、毛细管电泳法，以及高效液相色谱法等。当前GABA的测定以采用HPLC衍生化法和氨基酸自动分析仪法为多，但前者操作复杂，后者费用昂贵， 而采用HPLC—ELSD检测Y一氨基丁酸，由Y．氨基丁酸不需要衍生化，可大大简化操 作。另外，对不同采收期桑叶中的GABA含量暂时没有报道。 传统测定总甾醇含量多采用加显色剂的紫外可见分光光度法，一是经过改进 的硫酸汞显色法，二是甾醇类物质能够与醋酐、硫酸显色的特性反应。色谱法测定植物甾醇主要包括气相色谱法、液相色谱法、薄层色谱法和毛细管电泳法。 本文采用HPLC．ELSD检测甾 醇，该法不需要预先对样品进行衍生化，重现性好， 准确性高，操作简便，灵敏度亦很高，样品用量少，适于微量分析。现有的报道 一卜要是采用分光光度法测定桑叶中甾醇的含量，没有不同采收期含量变化的报道。
1桑叶中总黄酮的测定
1．1芦丁的分光光度法的测定原理 利用黄酮类化合物结构上的酚羟基及其还原性进行显色，一般片j硝酸铝一亚硝酸钠为显色剂，生成铝螯合物，测定吸光度，以芦丁为标准品计算出含量。
1．2芦丁标准曲线的制备 精密称取干燥恒重的芦丁标准品20．30 mg，用30％的乙醇在45℃芹右水浴条件r溶解，定容至100 mL，即得芦丁标准溶液0．20mg／mL。配置成0．04、O．08、 0．12、0．16、0．20 mg／mL系列浓度的标准溶液，分别置于25mL刻度试管中，各加5％业硝酸钠溶液1m乙，摇匀，放置6分钟，加入10％硝酸铝溶液1mL，摇匀，再放置6分钟后，加入5％氢氧化钠溶液lOmL，摇匀，放置15分钟。空白管调零，在k 510nm处测定吸光度A，做工作曲线。
1．3桑叶总黄酮含量测定 称取l h，提取液过滤，得滤液， g桑叶，料液比为1：30、80％乙醇水浴浸提3加入50mL容量瓶中，用70％乙醇定容至50mL。精确吸取5mL 二25mL的刻度试管中，加入5％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6分钟，加入10％硝酸锚溶液lmL，摇匀，再放置6分钟后，加入5％氢氧化钠溶液10mL，摇匀，放置15分钟。用分光光度计在k 510nm处测定吸光度A。根据芦丁标准工作曲线求出桑叶中黄酮 以芦丁计 含量。 精密称取桑叶1 mL，按照样品 g，在浸提液O力H／kO．20mg／mL的标准溶液1制备方法制备，测定其黄酮的含量。
1．4不同月份桑叶总黄酮含量的测定 分别取不同月份的桑叶lg，按1．3所述方法测定，测定各个月份桑叶的总黄酮含量。
2．1桑叶中总多糖分光光度法的测定原理 苯酚一硫酸比色法测定桑叶多糖的原理是桑叶多糖在浓硫酸的作用下，先水解为单糖，迅速脱水形成糠醛衍生物，然后与苯酚缩合为有色化合物，在488nm处有特征吸收。
2．2桑叶中总多糖标准曲线的制备 精密吸取0．10．60，0．70，O．80mL于试管中，分别加蒸馏水补充至1．OOmL，得系列对照品溶液。 向上述的对照品溶液中加入6％的苯酚溶液lmL，再向各管加入浓硫酸5mL， 震荡均匀后沸水浴加热15min，室温静置30min，住-488nm波长下测吸光度，绘制成葡萄糖标准 I线。
2．3桑叶总多糖含量的测定 h，过 取烘干后的桑叶粗粉5g，加入100mL蒸馏水，在70℃水浴锅中浸提滤，滤渣冉力nsoCh莺肇蒸馏水提取1h，合并二次滤液，在旋转蒸发仪中减J玉浓 h。 缩虿40mL左右，再加10％的三氯乙酸10mL，放进冰箱静置24 dmin的速度离心10rain，然后去除沉 将上述浓缩液在高速离心机中以10000淀，加入1／10的活性炭，存70℃的水浴锅中加热20min。取出浓缩液，趁热过滤， 滤出活性炭，在滤液中加入无水乙醇，使无水乙醇的含量达到80％。放进冰箱里 h。 面静置12 r／min的速度 取出上述含有无水乙醇的多糖粗提液，在高速离心机巾以10000离心10min，取其沉淀，用50mL的蒸馏水溶解沉淀以备用。 从上述桑叶多糖的粗提液中各取1mL，用蒸馏水稀释至100mL，再从中取1 mL，至试管中，加入6％的苯酚溶液1mL，再向各管加入浓硫酸5mL，震荡均匀后沸水浴加热15min，室温静置30min，在488nm波长下测其吸光值。 精密称取桑叶5 mL，按照样品制 g，在浸提液中加入O．1mg／mL的标准溶液备方法制备，测定其桑叶多糖的含量。
2．4去色素实验研究 除色素时，参考文献选用了两种去色素效果比较好的双氧水和活性炭做了实 min；活性炭浓度为 验。其中双氧水的浓度为20％11081，在50℃的水浴中加热30 min。 20％，在80℃的水浴中加热30 在桑叶粗提液中加入活性炭是为了去除桑叶中的色素，消除色素在测吸光值 时造成的影响。若加入活性炭的量不够或者加入时间，温度不够，则桑叶汁的去 色素效果不明显。若加入的量过大，加入时间过长，则会导致部分活性炭溶解在 桑叶汁中，测得的吸光度有偏差。 因此，以桑叶汁中的活性炭加入含量、JjH,4热,温度及力|I热时问设计正变实验， 得到去色素效果最明显的方案。试验设汁表如下表： 表2．1因素水平设计 Tablc2-I ofthclex‘clsoffactors Dcsign 根据桑叶多糖的正交实验结果，选择最佳去色素条件对葡萄糖标准品计算其损失率。
2．5不同月份桑叶总多糖含量的测定 分别取不同月份的桑叶5g，按2．3所述方法测定，测定各个月份桑叶的总 多糖含量。
3桑叶中卜脱氧野尻霉素的测定
3．1测定原理 芴甲氧酰氯 FMOC．CI 柱前荧光衍生．高效液相色谱法测定桑叶中1．脱氧野 8．5的硼酸盐缓冲溶液条件下，尻霉素 DNJ ，桑叶经O．05mol／L盐酸提取，在pHDNJ反应生成荧光产物，然后用高效液相色谱一紫外检测器测定i11J。流动相为乙柱前衍生，然后用高效液相色谱法进行分离测定，方法简便快速，灵敏准确，并具有衍生反应可在室温下进行，反应速度快，操作步骤简单以及衍生产物稳定等特点。
3．2桑叶中DNJ的提取 准确称取0．05 mL的离，tL,管中加入0．05mol／L的盐酸溶 g干燥的桑叶粉末于液lmL，涡旋混合30S，离心15min 转速12000r／min ，取上清液，残渣再加入0．05mol／L的盐酸溶液1mL，同前重复提取一次，合并两次提取液，置5mL容量瓶中加蒸馏水定容至5mL，备用。
3．3 DNJ标准液的配制 移取lmL甲醇溶解10 mg样品，配制成0．1mg／mL的DNJ标准溶液。稀释成 0．01 mg／mL、O．02mg／mL、O．04mg／mL、O．06mg／mL、0．08mg／mL的标准溶液。
3．4 DNJ的衍生化及测定方法 取DNJ标准液和上述提取液10 laL于1．5mL的离心管中，加10“L硼酸盐缓冲 mmol／L液 pH8．5 ，再加入20止的5 FMOC．CL的乙腈溶液，混匀后于20℃水浴反应20min，之后加入0．1mol／L的H’氮酸10 pL，让剩余的衍生化试剂反应，最后加入950 laL的0．1％ V／V 的醋酸水溶液，混匀后用0．45pm的微孔滤膜过滤后，取20吐进样分析。 以乙腈为流动相A，醋酸水溶液为流动JCHB。降乙腈所占流动相总量的比例逐渐减低，从图谱上石乙J|j占的比例越大出峰的时川越早，然后再比较各种比例的峰形，还足以乙腈为60％时出峰情况较好。选定液相条件：流动相为乙腈：0．1％ nm。 醋酸 60：40，V／V ；流速：o．8mL／min；紫外检测器254 精密称取桑叶0．05 mL，按照样 g，在浸提液中加入O．01mg／mL的标准溶液品制备方法制备，测定其DNJ的含量。
3．5不同月份桑叶中DNJ含量的测定 分别取不同月份的桑叶0．05 g，按上述方法测定，测定各个月份桑叶的DNJ含量。
4桑叶中y一氨基丁酸的测定
4．1 Y一氨基丁酸的测定原理 Y．氨基丁酸 GABA 紫外吸收较弱，本实验采用ELSD 蒸发光检测器 进行测定。ELSD作为通用型检测器克服了HPLC常碰到的麻烦，消除了溶剂的干扰和因温度变化引起的基线漂移，即使用梯度洗脱也不会产生基线漂移。
5桑叶中甾醇的检测方法
5．1桑叶甾醇的测定原理 本文用蒸发光散射检测器 ELSD 测定桑叶中甾醇中的含量，解决了D．谷 甾醇等在紫外区域吸收峰临近流动相的末端吸收，色谱峰易被淹没的问题。在选定的色谱条件下，供试溶液中D一谷甾醇与相邻组分分离度良好。
5．2标准溶液的配置 精密称取13一谷甾醇的对照品0．24 g，甲醇溶解，并于100mL容量瓶中定容， 摇匀，得No．24mg／mL微孑L过滤得待测标准溶液样品。分别精密吸取20此的标准样品溶液，经 O．45 1．tm滤膜过滤，进液相分析。
5．3桑叶的甾醇提取和测定方法 称取桑叶10g，粉碎过筛，放置于索氏提取器中，加入200mL的氯仿放置过夜，加热回流提取4h，在旋转蒸发仪中叫收氯仿至干燥。用甲醇定容至100札，经0．45 lam滤膜过滤，进液相分析。
型蒸发光散射检测器，C18反相柱4．6×250mm；柱温25℃，流动相为甲醇，流速0．8mL／min，ELSD漂移管温度：60℃。 精密称取桑叶lO mL，按照样品 g，在浸提液中力HA,0．24mg／mL的标准溶液制各方法制备，测定其i 醇的含量。
5．4不同月份桑叶中甾醇含量的测定 分别取不同月份的桑叶lO g，按上述方法测定，测定各个月份桑叶的甾醇含量。
6实验结果与讨论
6．1桑叶中总黄酮含量的测定结果
6 . 2工作曲线的绘制 取系列浓度的芦丁标准溶液，在510nm下测定吸光度，绘制工作曲线，见下 图所示。 O．7 0．6 O．5 嚣0．4 j_]蕾0．3 0．2 0．1 O 0 O．2 0．4 0．6 0．8 1 1．2 芦丁浓度 mg／mL 图2-l总黄酮标准曲线 Standardcurveofflavonoids Fig．2-1 芦J‘从浓度0．04R2 O．9992，在2．3．1．3所述的测定方法进行测定。经换算，用加标准样晶的测定结果减去未加标准样品的测定结果，经计算得到标准样品的回收率98．67％。
6 . 3不同月份桑叶总黄酮 以芦丁计 的含量 取／f、 同月份的桑叶测定其桑叶总黄酮的含量，并汁算相当标准偏差。结果见表2—2。 表2．2不同采收期对桑叶总黄酮的含量的影响 Tab．2·2Effectsofdifferent oncontentofflavonoids leaves harvestingstage ofmulberr ．，7 由上述数据判断，8月桑叶中总黄酮的含量较高，因此在以总黄酮为j!要活性成分的产品中选择8月份桑叶，效果更好。
7桑叶中总多糖的测定结果
7．1工作曲线的绘制 精密吸取0．01 mg／mL、O．03mg／mL、O．05mg／mL、O．07mg／mL、0．09mg／m 的葡萄糖溶液，在488 nm下测定吸光度，绘制工作曲线 见图 26 浙江工商大学硕十学位论文 1．4 1．2 1 吸 韶0．8 ／U 度0．6 0．4 O．2 O O O．02 0．04 0．06 O．08 0．1 浓度 mg／mL 图2．2桑叶多糖的杯准工作l山线 of Standardcun‘eMulberr3’poly‘saccharide Fig．2-2定方法进行测定。
7．2去色素效果的比较 r／min的速度下离一t二,lo 将双氧水和活性炭处理过后的多糖溶液，分别住10000 mL，再从min，,qjsomL蒸馏水溶解其沉淀，取1mL溶液再川蒸馏水稀释至100中取1mL，用苯酚．浓硫酸显色，在488nm的波长下测定其吸光值，其结果见下表 表2．3去色素效果比较 Table2-3 tothe Comparisonpigment 分析上表，舣氧水对多糖溶液的去色素效果远远低于活性炭。分析其原因，可能是由于双氧水的强氧化性，把原桑叶汁中的部分多糖也同时氧化了。且目前对双氧水是先氧化色素，还是先氧化多糖还没有进行深入研究，从而很难控制双氧水在去色素过程中的加热时间、加热温度等变量的影响。因此，本实验在以下的实验中选用活性炭去除色素，利用正交试验得到去色素效果最明显的方案。 注：“lO”分为最高分，表示去色素效果最明显；分数递减去色素效果也随着递减。 其冈素指标图如下图所示： 图2．3 去色素比较正交实验因素指标图 to index the factor Fig．2-3ComparedRemovingpigmentorthogonal map 对上述实验结果进行直观分析和方差分析，结果表明，添加的活性炭比例和加热温度对结果有显著性影响，其他因素为非显著性影响因素，最佳提取工艺根据结果可见为A282C3，方案5的去色素效果是最明显的，其次是第6组。在第7、8、 9--"组试验中，过滤后得到的溶液有淡淡的灰色产生，其中以第9组的灰色最深。 这三组中加入的活性炭的数量增加，但是效果低于第5，6两组。出现这样的结果， 从理论上分析可能是由于加入的活性炭过多，第9组加入的活性炭的数量和加热时间都是最多的，水浴加热时部分活性炭溶解在桑叶汁中，导致呈现出浅灰色。 对比欧阳臻采用80℃脱色2h和孙莲等用双氧水脱色4h，本实验改进之后使脱色 速度加快，最佳方案是桑叶汁中加入1／10的活性炭，在70℃的温度下加热30min。 为了研究加入活性炭后抽滤，对原桑叶汁的吸光度是否造成较大的影响，在此取标准葡萄糖溶液10mL，用蒸馏水稀释至50mL。取其中的40mL ．／N入1门0 即4克 活性炭，与桑I-Il’汁一起在70℃的水浴锅内加热30min后抽滤。将这抽滤之后的葡萄糖溶液与为加入活性炭的10mL的葡萄糖溶液 E488ilm处进行吸光度测定，比较其数值。结果见下表； 表2．5活性炭对葡萄精吸光值的影响 Tab．2—5Acti、’atedCarboneffectonabsorbanccvaluesof glucose 注：其中标2为加入活性炭加热后抽滤之后的一组溶液，含量为在干重l I的含量 由表2—5可知，加入活性炭一组最后得到的吸光度数值比标准的葡萄糖略微偏小。分析可能是由于加入活性炭后，在加热作用下其吸附能力较强，吸附了标准葡萄糖溶液中部分糖，使得其浓度偏低。但是在其他几组实验中，用该活性炭吸附色素是相对去色素效果最明显的，吸附多糖含量也相对最小的一种方法，因此，本实验中选用活性炭作为色素的吸附剂。
7．3不同月份桑叶总多糖的含量 本实验对不同月份的桑叶进行了测定，并重复测定，根据标准曲线，计算其含量，并计算相当标准偏差。 表2．6不同采收期对桑叶多糖的含量的影响 Tab．2—6Effectsofdifferent oncontentof of leaves stage polysaccharidemulberry harvesting 由上述数据判断，9、10月桑叶中桑叶总多糖的含量较高，因此秋桑叶进行工利用能更好的利用桑叶资源。
8桑叶中DNJ的测定结果
8．1 DNJ的色谱条件确定 乙腈为流动相A，醋酸水溶液为流动相B。调整乙腈所占流动相总量的比例，较出峰的情况：从图谱上看乙腈的比例越大出峰的时间越早，然后再比较各种例的峰彤，还足以乙腈为60％时的为最尖，最对称。所以最后选定是60％乙腈那组作为流动相。 分别对DNJ标样、桑叶和窄白溶液的衍生化反应混合物进行HPLC分析，DNJ样的色谱图如图2—4，空白液的色谱图见图2．5，桑叶的色潜图见图2．6。图2．4DNJ标样的高效液相色谱图 of solution DNJstandard Fig．2-4High—performanceliquidclu．omatographyseparation图2．5空白样品的高效液相色潜图 ofblartk Fig．2-5High—performanceliquidchromatographyseparationsample 图2．6桑叶粉试样的I台莰5 液相色谱图 of solution Fig．2-6High-performanceliquidclu'omatograph,,’separationmulberr3．’powder图2—4有3个主色谱峰。图2—5则只有2个li色谱峰，减少DNJ标样的加入量， 则色谱峰1的峰面积线性降低。由此可以断定，色潜峰l为DNJ．FMOC。观察图2．4， 图2．6，l一脱氧野尻霉素标准品的出Ilj午情况相当良好，峰的对称性也不错，色谱峰的尖端放大后，说明杂质的T扰不大。这对后面的分析的准确性也提供了一定的保证，由桑叶样品色谱图2．6，看出桑叶巾的DNJ表现出较好的分离效果。
8．2标准曲线 分别精密量取按照1．2．3的方法进行衍生化反应的DNJjl：tji准溶液1．00、2．OO、 4．OO、8．OO、12．00、16．oo止，用甲醇补允至20止。在上述色谱条件下进行分析， 记录色谱。 300 250 3200 o o 囊150 叠奎100 50 0 0 0．02 0．0，10．06 0．08 0．1 0．12 浓艘 mz／mL 图2．7DNJ标准曲线 StandardcuFqeofDNJdetermination Fig．以色谱峰嘶积 Y 对标样溶液的质量浓度 X ，作线性回归，结果见图 2．7，DNJ的浓度与色谱峰面积呈明显的线性关系，经回归分析，二者的回归方经换算，片J加标准样品的测定结果减去未加标准样品的测定结果，经计算得到标准样品的回收率94．34％。
8．3不同月份桑叶中的DNJ的含量测定 本实验对不同月份的桑叶进行了测定，并重复测定，根据标准曲线，计算其含量，并计算相当标准偏差。结果见表2．7 表2．7不同采收期对桑叶中DNJ含量的影响 Tab．2—7Effectsofdifferem oncontentofDNJof harx’estingstage mulbcrr3’Icax’CS 对／f‘I司生长季节桑叶巾DNJ测定结果表明，DNJ含量与生长季节自‘关，5月份含量较低，然后逐渐增高，7、8月份较高，9、10月份又降低了。
9桑叶中y一氨基丁酸的测定结果
9．1Y一氨基丁酸的测定条件确定 甲醇为流动相A，三氯乙酸水溶液为流动$1-]B。调整乙腈所占流动相总帚的 比例，比较出峰的情况：从图谱上看甲醇的比例越大出峰的时间越早，然后再比较各种比例的峰形，还是以甲醇为40％时的为最尖，最对称。所以最后选定是40％ 甲醇的那组作为流动相。 分别对GABA标样、桑叶和空白溶液的衍生化反应混合物进行HPLC分析，GABA标样的色谱图如如图2．8，桑叶的色谱图见图2—9。 32 浙江工商人学硕士学位论文 图2-8GABA标准占6的高效液相色谱图 ofGABAstandardsolution Fig．2-8High-performanceliquidclaromatograph3’separation图2-9桑叶粉的高效液相色谱图 of solution Fig．2·9High·performanceliquidchromatographyseparationmulberrypowder
9．2 Y一氨基丁酸工作曲线的绘制 以色谱峰面积 Y 对标样溶液的浓度 x ，作线性回归，绘制标准工作曲线，结果见图2．10。Y一氨基J酸标准曲线 0TheStandardcurveof acid Fig．1 y-ammobut3Tic 从图中可见，刈‘各点进行回归相关分析，可以得出其线性回归方程：Y O．025．0．40 mg／mL范围内与其色谱峰面积的线性关系良好。在2，3．4．3所述的测定方法进行测定。经换算，刚加标样品的测定结果减去未加标样品的测定结果，经 l％。 计算得到标准样品的网收率99．3 。
9．3不同月份桑叶中GABA的含量测定 本实验对4、 同月份的桑叶进行了测定，并重复测定，根据标准曲线，计算其含量，并计算相当标准偏差。结果见表2．8。 表2．8不同采收期对桑叶中GABA含量的影响 Tab．2—8Effectsofdifferent oncontentofGABAof leaves harvestingstage mulberry 对不同生长季节桑叶中GABA测定结果表明，GABA含量与生长季节有关， 7月份含量最高，达到1．91mg／g，7月以后逐渐降低。
10桑叶中甾醇的测定结果
10．1甾醇工作曲线的绘制 取13一谷甾醇系列标准品，进液相分析。甾醇标准品及桑叶甾醇的色谱图见图 2—1l和图2—12。 1 图2—1B一谷甾醇标样的r音i效液相色谱I矧 of standard lj-Sitosterol Fig．2-llHigh-performanceliquidclu'omatograph37separation solution 图2．12桑叶粉试样的高效液相色谱图 solution Fig．2·12High-performancechromatographyseparationofmulberrypowder liquid 取浓度为0．24 mg／mL的标准溶液，每次进样20止，测峰面积，共5次，RSD O．22％。3-谷甾醇对照品峰的平均保留时间约为23．9min。与共存的其他成分分离良好，见图2．12。样品在对照品峰的相应保留时间位置上出峰，并与其他成分分离良好。
10．2甾醇工作曲线的绘制 以色潜峰面积 Y 对标样溶液的浓度 X ，作线性回归，绘制标准工作 曲线，结果如图 6．00 5．OO —I． 8 暑3． g 囊．、 1． O ：／-- 0．00 O O·05 0·25 O·3 O·1；?iJ坐O；11n95，，mL，O·2 图2-13陆谷甾醇的标准曲线3Standardcurvcof3-Sitostcroldctcrmination Fig．2-1 从图巾可见，对各点进行同归相关分析，可以得卅其线性回p1力。程：Y 20．1 13x．O．3934，R2 O．996。可见甾醇溶液的浓度在O～O．3 mg／mL范围内，与其 色谱峰面积的线性关系良好。在2．3．5．3N述的测定方法进行测定。经换算，用加 标准样品的测定结果减去未加标准样品的测定结果，经计算得到标准样品的回收率97．64％。
10．3不同月份桑叶甾醇的含量 本实验对不同月份的桑叶进行了测定，并重复测定，根据标准曲线，计算其 含量和相对标准偏差。 表2．9不同采收期对桑叶甾醇含量的影响 Tab．2-9Effcctsofdifferent content of leaves on harvestingstage ofIj·Sitosterolmulberry 对不同生长季节桑叶中甾醇测定结果表明， 5月～8月桑叶中的含量呈下降 趋势，lO月后又上升。其中5月份甾醇含量最高。
小结 、采用比色法在510nm处测定吸光度。以乙醇为溶剂的正交实验表明：桑叶总黄酮浸提的最佳工艺条件为80％的乙醇溶液、温度为80℃、料液LLl：30、浸提3h，此时的黄酬浸出率最高。测定不同月份桑叶中总黄酮的含量，芦丁标准品的回收率98．67％，其中5月份的含量最低，只有4．75 mg／g，8月份的桑叶中 1 总黄酮的含量最高，达到9．3mg／g。 2、采取苯酚．硫酸法测定桑叶总多糖的含量。加入10％的活性炭，70℃的温 度下加热30min可以去除桑叶中色素的干扰。7月份的桑叶总多糖含量最低，只有5．73 mg／g，9月份的桑叶中总多糖的含量最高，达N8．68mg／g。 3、采用荧光试剂芴甲氧酰氯 FMOC—CL 与DNJ柱前衍生，然后用高效液相色谱法进行分离测定，方法简便快速，灵敏准确，并具有衍乍反应可在室温下进行，反应速度快，操作步骤简单。标准品的同收率98．67％，9月份的桑叶含量最低，只有0．09 m‖g。 mg／g，8月份的桑叶巾DNJ的含最最高，达到O．46 4、本文改进了桑叶1，．氨基丁酸的测定办法：GABA紫外吸收较弱，本实验标准品的回收率99．31％，7Jq份的桑IIf．GABA含量最高，达到1．91 mg／g，10月份的桑叶含量最低，只有1．50 mg／g。 5、参考前人的研究成果，改进了桑叶甾醇的测定方法，用HPLC．ELSD测定桑叶中甾醇中的含量，解决了D一谷甾醇等在紫外区域吸收峰临近流动相的末端吸收，色谱峰易被淹没的问题。标准品的回收率97．64％，9月份的桑叶甾醇含量最低，只有0．38 mg／g，5月份的桑叶巾甾醇的含罱最高，达No．57mg／g 第3章桑叶及其提取物降血糖的效果 3．1前言 桑叶作为药食两用植物含有多种有效成分，具有良好的降血糖、降血脂 、抑制癌细胞等诸多药理作用。1963年Shart等首次报道了桑叶水提取液的 降血糖作用。方晓等报道，桑叶粉沸水提取得0．40 mL／d浸液 g／mE浸液，以2 给四氧嘧啶致糖尿病大鼠灌胃，观察30天测定血糖水平，结果表明桑叶浸液对实验性糖尿病大鼠有明显的降血糖作用。俞灵莺研究桑叶总黄酮对 F酶糖基化 的抑制作川，其中0．1g／L浓度组从孵育第1天起即显示出抑制作用，结果桑叶总黄酮对体外蛋白非酶糖化具抑制作用140I。陈福君等曾报道桑叶多糖对四氧嘧啶诱导的糖尿病动物的降m糖作用，桑叶叶l提取桑叶总多糖 TPM ，给四氧 降m糖作用 P O．01 。 小鼠进行灌胃实验验证桑叶降血糖功效。奉研究利川桑叶中的总黄酮阻断蛋白非酶糖化，DNJ生物碱类物质抑制葡萄糖苷酶。苗．先应用桑叶剂量l g／ kg．d 、2 g／ kg．d 、3g／ kg．d 的提取液进行灌胃，测定其向．糖浓度，判定桑叶的降血糖效果，再从两方面分析桑叶降血糖效果：一是对桑叶提取物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取得到各种组分进行灌胃；二是提取出桑叶中的总黄酮、总生物碱以及总多糖等，按照组分进行小鼠降血糖实验，测定其血糖值。通过以上两种方案的降血糖效果比较得出桑叶中降血糖的组分。
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