利用蛋白质结晶进行生物学表征

单克隆抗体已经成为重要的治疗方法，预计到2020年将产生1,250亿美元的销售⁽¹⁾。 鉴于潜在的收入，生物制药公司有很大的动力去寻找新的方式来提供其药品并延长专利的使用时间。许多治疗方法是使用大剂量低浓度静脉注射进行的。⁽²⁾

                             图1 在体外测定可溶性和结晶性英夫利昔单克隆抗体生物活性的比较

通过将单分子药物排列在有序晶格中，促进具有高浓度，低粘度和低体积的传统生物治疗药物。该技术是围绕用于治疗的蛋白质结晶，交联和复合的专利组合，包括寻找理想的结晶条件和稳定的结晶配方的技术，以及开发结晶悬浮药物产品GMP方法的技术。对于患者，这允许通过皮下注射而不是较长的静脉注射，并使用较小的针头以增加舒适度。用Crystalomics平台生产的蛋白质晶体也可以结合以获得持续释放性质，将每日治疗转化为每周治疗。已经证明结晶疗法的体外和体内功效谱与其可溶性较大体积的对应物一样有效⁽³⁾（图1,2）。

         图二 比较皮下和静脉注射的可溶性英夫利昔单抗以及施用结晶英夫利昔单抗的药代动力学特征

图三 监测检测器强度随着时间的推移，晶体颗粒在前5个小时内保持亚微米尺寸。 约6小时后，通过大颗粒沉降速度确定尺寸测定。在两个时间点加入PBS，分别停止结晶反应并开始溶解晶体。

图四 在约三小时时的亚微米粒度分布

在为客户开发晶体药物悬浮液时，我们遇到了几个问题⁽⁴⁾。 赋形剂必须从母液结晶溶液调整成适合患者注射的制剂，并含有通常被认为是安全的成分（GRAS）。溶解，聚集或不稳定的晶体是没有效用的。在配制晶体悬浮液期间，制剂缓冲液中晶体的ζ电位是特别值得注意的，ζ电位绝对值大于25mv的颗粒往往会彼此排斥并由于静电排斥而保持相对稳定⁽⁵⁾。一旦识别出几个制剂候选物，就会开始对每个候选物进行大量的晶体悬浮液的生物物理学表征。MANTA仪器可以帮助配方设计师获得粒度分布（PSD），结晶配方的速率，溶解速率以及ζ电位，所有这些都只需1-2 mL样品。通过将几个关键测定结合到单个测量中，该系统已被证明对于节省时间和样品是非常有价值的。

图五 综合分析5.5小时记录视频中的300幅视频影像（7.5@40fps），可得到进行布朗运动的小颗粒以及定速沉降的大颗粒信息。通过Stokes公式与已知的晶体密度，就可得到这些大颗粒的直径超过10μm。其浓度约为1.1×10⁶/mL。

图六 通过光强的降低监测晶体溶解

ViewSizer®3000系统通过跟踪粒子布朗运动（NTA），是进行粒子计数和粒度测量的先进仪器。与使用一个激光激光器（单个波长）照射胶体中颗粒的常规NTA仪器不同ViewSizer®3000系统使用了拥有专利技术的三个固态激光器系统，其中波长为450nm，520nm和650nm（标准配置），以匹配彩色摄像机的灵敏度曲线。通过改变激光器的功率（蓝光激光器为70mW，绿光激光器为12mW，红光激光器为8mW）软件可以更容易地观察和跟踪颗粒运动，用户可以有效扩展粒度测量范围。这也克服了常规NTA仪器的基本缺点：无法对形成多分散样品的宽分布颗粒进行准确测量。结果表明，在不同波长下，这种不同功率的应用对于检测由于结晶或溶解而改变大小的样品也是至关重要的。

通常，用于布朗运动尺寸范围内的样品，最好是圆形的，或者椭圆轴比率<3（这种限制来源于爱因斯坦布朗运动理论的假设），粘度应小于约4cP（粘度过高的样品对于测量其布朗运动不利（图4），粘度约为1 cP的水中颗粒的检出限为<2μm）。颗粒的折射率应与溶剂的折射率不同，以达到足够的散射光。（通常，在n = 1.33的水中，胶体的折射率如果大于1.4被认为是能够良好散射的）

图3显示了持续约8小时的结晶和溶解实验。 在最初几个小时，样品结晶速度非常慢。 在胶体恒定混合约180分钟后，我们通过跟踪颗粒的布朗运动来测量粒度分布。 结果显示D50粒径为333nm，总粒子浓度为2.5×10⁷个/ mL的轮廓。 结晶近300分钟后，结晶速率显着增加。 最大颗粒（直径> 5μm）的浓度和尺寸足以根据沉降速度测量粒径（图5）。

小颗粒经历布朗运动，非常大的颗粒以恒定速度下沉。 通过使用斯托克斯方程和已知的晶体密度，我们可以估计大颗粒的直径。

约420分钟后，加入1mL标准磷酸盐缓冲盐水（PBS）至2mL胶体中，停止结晶过程。 在440分钟内将另外1mL的PBS加入到实验中开始快速溶解颗粒。 图6是初始图中溶解部分的扩展版本。我们通过观察由布朗尺寸测量仪器的相机记录的散射光的不同强度自动跟踪结晶和溶解的整个过程，并通过标准的ViewSizer®3000软件进行处理。 该分析包括记录的视频的长度（通常每几秒钟几帧，混合视频之间的样本），混合速度（每分钟搅拌器转数），胶体温度在0.1℃内的控制以及记录平均总强度 作为时间序列的每个视频的记录图像（帧）。

ViewSizer®3000系统通过消除调度图像捕获的需要来节省时间。 它以低容量提供以前不可实现的实时大小分布数据。 通过了解和控制低体积的结晶反应，从而节省了MAb产品。 来自ViewSizer®3000的见解可以有效控制结晶反应，这对于鉴定理想的结晶条件和稳定的结晶配方是非常有用的。

参考文献

[1] Ecker DM, Jones SD, Levine HL. The Therapeutic Monoclonal Antibody Market. mAbs 7(1) 2015: 9–14.

[2 ]Yang MX, et al. Crystalline Monoclonal Antibodies for Subcutaneous Delivery. PNAS

100(12) 2003: 6934–6939.

[3] Kovarcik DP, Wittbold W. Protein Crystals: Reshaping Traditional Biotherapeutic Formulations. Drug Dev. Delivery 16(5) 2016.

[4] Crystalomics Formulation Technology. Althea: San Diego, CA; http://altheacmo.com/ wordpress/wp-content/uploads/2014/1 1/ CrystalomicsBrochure_DownloadablePDF.pdf.

[5] Yadav S, Shire SJ, Kalonia DS. Factors Affecting the Viscosity in High-Concentration Solutions of Different Monoclonal Antibodies. J. Pharm. Sci. 99(12) 2010: 4812–4829.