师兄,我把分子筛的说明书弄丢了,没有不同蛋白出峰位置的图做参考了,怎么办?
我
师兄
哈哈,过了这么多年的柱子,你还没记住啊?
?快说怎么办。
我
师兄
首先,你可以去GE官网(http://www.gelifesciences.com/)下载?当然,作为师兄,必须来个更高级的,你可以用标品蛋白在你的柱子上跑一个专为你自己的柱子量身定跑的标品图——分子筛也是有marker的~
还能这么玩?
我
敲
黑
板
分子筛Marker,也就是确定分子筛不同分子量球形蛋白出峰位置即保留体积(时间)的标品蛋白,GE生命科学提供两套分子筛Marker:
高分子量分子筛Marker(High Molecular Weight,货号28-4038-42):
低分子量分子筛Marker(Low Molecular Weight,货号28-4038-41):
那也就是利用分子筛Marker,我就可以跑出属于我的柱子的标品图了?
我
师兄
哈哈,不仅如此,师兄再教你个更高级一点的用法。那就是,还能准确的计算一个蛋白天然状态下的分子量,以及复杂样品,比如:蛋白水解为多肽后的分子量分布范围。方法如下:
我们可以在对应分子筛上跑一个合适该分子筛分离范围的标品Marker,比如下图:(该图是在Superdex 200 increase 10/300 GL柱子上跑出的标品图,具体分子量如上所述)
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从该图上,我们可以借助于ÄKTA UNICORN的Peak Integrate功能,准确的确定每个峰的出峰位置即保留时间。
03
然后将所得到的出峰位置的值即VR带入如下公式去计算,得到Kav值:其中的外水体积可以用分子筛Marker中的Blue Dextran 2000去测定,大约占整个柱体积的30%-40%。
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接着,拟合一条标准曲线,以Kav为Y轴值,以lgMr为X轴值。如下图:
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有了标曲,我们只需要把未知蛋白过柱(同一根柱子,同样系统和操作)后的出峰位置VR带入标曲公式进行计算即可得到其分子量Mr的值。同理,也可以做一群复杂蛋白的分子量分布范围分析。值得注意的是,每根分子筛的标曲中的Kav值一般在0.1至0.7之间是呈线性关系的,这也是我们为什么建议要选择尽量靠近分子筛分离范围中间的这个范围来使用分子筛的原因,因为其分离效果会相对更好。
?
我
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