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个试剂盒搞定外泌体研究:磁珠法纯化,流式分析

北京大学第三医院中心实验室 2019-11-18 08:02:25

外泌体(Exosome),是由多种类型的细胞,如T、B、NK细胞、以及肿瘤细胞等分泌的一种囊泡状结构,直径在30-100nm之间,又称膜外小体(Extracellular Vesicles, EVs)。外泌体常携带其起源细胞的多种生物分子,包括蛋白质、脂类和核酸,因此,外泌体参与了多种生物学过程,包括免疫监控、血液凝固、神经传递、干细胞维护和组织修复等。

图1:外泌体形成和作用方式示意图。

Difficult:外泌体研究   

外泌体纯化:难

调查发现,约有56%的实验室采用超速离心法分离外泌体,但该方法有其局限性:

  • 耗时耗力:需8-30个小时

  • 处理样本少:每次最多处理6个样品

  • 需要大量的起始材料

  • 产量不高


外泌体分析:难

由于外泌体体积小(直径30-100nm),流式检测也是一大难题。

图2:由于外泌体体积小,很难用流式检测到单个的外泌体。检测到的颗粒更像是外泌体群或聚集体。

美天旎为外泌体研究而专门研发了相应的试剂盒,Exosome isolation kit和MACSPlex Exosome Kit,分别用于外泌体的富集和分析。

外泌体磁珠纯化   

基于美天旎的MACS技术,利用外泌体表面常见的四次跨膜蛋白CD9、CD63和CD81,分别研发了四款磁珠试剂盒,用于阳性分选外泌体,简单三步(磁珠孵育、磁场分离、洗脱,如图3),省时省力,无需进行超速离心,且样本体积最小可至0.5mL

图3:利用美天旎Exosome isolation kit,简单三步(磁珠孵育、磁场分离、洗脱),1.5h内完成外泌体的纯化。

外泌体流式分析   

分析外泌体蛋白的传统方法有western blot、质谱分析、扫描电镜和流式分析。由于外泌体的直径太小(30-100nm),很难通过标准的流式检测方法对其进行分析。为此,美天旎研发了MACSPlex Exosome Kit, human(#130-108-813)试剂盒,用于简单、快速的分析外泌体表面37种潜在蛋白

图4:MACSPlex Exosome Kit原理和步骤示意图。

MACSPlex Exosome Kit原理和步骤:

  1. MACSPlex Exosome Kit含有耦联39种抗体的捕获微球,其中2种同型对照抗体,因此可以一次检测37种潜在的蛋白marker。【外泌体与捕获微球共孵育后,表达不同表面抗原的外泌体被含相应抗体的捕获微球识别并结合,进而形成捕获微球-外泌体复合物】。

  2. MACSPlex Exosome Kit还包含荧光素标记的检测试剂,包括常见的三种外泌体marker,CD9、CD63、CD81。【根据表面抗原不同,检测试剂识别并结合到捕获微球-外泌体复合物上,形成带有荧光标记的捕获微球-外泌体-CD9/63/81检测试剂复合物,即可通过荧光强度进行流式检测】。


有图有真相

不同来源的外泌体表达的肿瘤抗原标记明显不同

利用MACSPlex Exosome Kit对黑色素瘤细胞和结肠癌细胞中的外泌体进行分析。黑色素瘤来源的外泌体都是MSCP+的,但却几乎不表达CD326。同时,流式分析可见,不同肿瘤来源的外泌体表达的抗原标记也是明显不同的。


图5:利用MACSPlex Exosome Kit对黑色素瘤细胞和结肠癌细胞中的外泌体进行分析。


结合美天旎MACSQuant流式细胞仪预设程序“MACSPlex_Exosome”,能够实现外泌体的全自动检测和分析。

图6:利用MACSPlex Exosome Kit分析表达不同表面Marker的外泌体分群情况。

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