摘 要：利用大米成分、H2SO4、丙酮、NaBrO3和MnSO4组成的非线性化学体系，研究了2种不同产地的大米及其混合物的非线性化学指纹图谱。利用这些指纹图谱的直观特征和系统相似度模式识别对相应大米进行了鉴别，利用指纹图谱的定量信息对大米混合物中各种大米的含量进行了测定。结果表明：非线性化学分析法可准确鉴别不同产地或品种的大米，对由2种大米互掺形成的混合物也可准确进行定量评价，方法简便、快速。
关键词：非线性化学分析；二元混合物；品种鉴别；含量测定；大米
我国大米资源丰富，其淀粉含量高达75%～82%，无水浸出率高达90%～93%，含脂肪低，无多酚物质，并含有较多的泡持蛋白，是啤酒酿造中普遍使用的一种麦芽辅助原料。因市场需求啤酒的风味逐渐趋于淡爽型，且因市场竞争加剧和生产技术成熟，大米使用比例在不断增加。大米淀粉含量高于其他谷类，蛋白质含量低。用大米代替部分麦芽，不仅麦汁的浸出率高，而且可以改善啤酒风味、降低啤酒的色泽。我国啤酒生产中大米用量一般在1/3～1/5，若采用外加酶法糖化工艺，大米用量可达50%左右。近年来，啤酒的质量尤其是风味质量已成为当前酿酒界最关心的问题，而大米是导致啤酒产生老化风味的重要因素之一。美国AB啤酒公司曾研究了大米品种对啤酒酿造的影响，发现大米品种对浸出率、醪液黏度、麦汁过滤速度和麦汁的可发酵性等方面有明显的影响，从而影响啤酒的风味。用不同大米酿造的啤酒产生不同的风味，故选择大米、提高产品风味质量、延长啤酒保质期，是酿造师和风味化学家们努力的方向之一。
基于非线性化学反应原理及其应用研究的成果[1-9]，张泰铭等提出和系统地研究了非线性化学指纹图谱技术[10-13]，并推动了这一指纹图谱技术深入研究和应用的发展[14-26]，为分析化学的学科分支-非线性化学分析的研究和应用在理论和技术上奠定了基础。本文介绍一种在啤酒生产中通过非线性化学分析来鉴别不同大米及测定其二元混合物中各种大米含量的方法。
1.1 材料与试剂
试剂：1.00 mol/L H2SO4溶液、1.00 mol/L丙酮溶液、0.800 mol/L NaBrO3溶液、0.080 0 mol/L MnSO4溶液。试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。
样品：龙江31大米，空育131大米。所用大米样品为华润雪花啤酒(中国)投资有限公司提供。
1.2 主要仪器设备
MZ-1B 型非线性化学指纹图谱测定仪(湖南尚泰测控科技有限公司)；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌水浴锅(巩义市予华仪器有限公司)；DZ-1BC型真空干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)。
1.3 实验方法
1.3.1 样品预处理
将大米样品粉碎过100目筛，置其于DZ-1BC型真空干燥箱中，于60 ℃烘干6 h后，装于密封袋并放在干燥器中备用。
1.3.2 操作要点
准确取适量大米样品粉末和25.00 mL H2SO4溶液于18×180 mm的试管中，将试管置于DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌水浴锅中，使样品在82 ℃水解7 h。然后，移取12.00 mL MnSO4溶液，5.00 mL丙酮溶液和15.00 mL蒸馏水至反应器中，再将试管中水解完毕的样品溶液定量转移至反应器，盖好带注射孔和电极的反应器盖，开启仪器。将恒温槽设置为40℃，打开循环泵和磁力搅拌器(850 r/min)，打开菜单开始采集数据，搅拌5.0 min时通过注射器迅速加入5.00 mL NaBrO3溶液(该溶液保持在40℃恒温水浴中)。采集数据直到所测电位E不随时间t变化为止。
1.3.3 方法稳定性实验
取龙江31号大米为样品，分别在第1天、第2天、第8天、第15天、第30天和第60天检测其指纹图谱，以6次测定的指纹图谱参数的平均值为参照，每个指纹图谱的系统相似度分别为0.998 3、0.998 1、0.998 4、0.998 7、0.999 0和0.998 9。该结果表明方法稳定性很好。
1.3.4 方法重复性试验
取龙江31号大米为样品，平行测定5次，检测指纹图谱，考察该方法的重复性，以5次试验的指纹图谱参数的平均值为参照，每个指纹图谱的系统相似度值分别为0.999 1，0.998 7，0.998 3，0.999 3，0.998 8。该结果表明方法有很好的重复性。
2.1 非线性化学指纹图谱基本特征信息
非线性化学指纹图谱中包含直观信息和参数信息[12]。其中直观信息包括指诱导曲线、波动曲线、停波曲线和波峰形状等，而可量化信息则包括峰谷时间(tcan)、峰谷电位(ecan)、峰顶时间(tpet)、峰顶电位(epet)、诱导时间(tind)、起波电位(euns)、停波时间(tune)、停波电位(eune)、平衡时间(tequ)、平衡电位(eequ)、波动幅度(Δeund)、最大波幅(Δemax)、波动周期(τund)、波动寿命(tund)和波峰数目(nwav)等[12]。这些参数信息对指纹图谱的系统相似度评价具有重要作用。如空育131大米指纹图谱的部分特征信息见图1。
e-f: 诱导曲线; f-g: 波动曲线; g-h: 停波曲线; e和h分别为非线性化学反应的起点和终点
图1 空育131大米指纹图谱的部分特征信息
Fig.1 Nonlinear chemical fingerprint of kongyu 131 rice and its part of feature information
2.2 大米检测用量对指纹图谱的影响
非线性化学指纹图谱是一种动力学指纹图谱，样品成分及其浓度的变化都会对该指纹图谱产生影响，导致该指纹图谱的直观特征和参数信息发生变化[11-12]。当反应液体积一定时，样品检测用量越大，反应液中该样品溶出成分的浓度就越大。因非线性化学指纹图谱不仅对样品成分变化很敏感，而且对样品中相同成分含量的变化也会产生响应，即相同成分的含量变化不仅引起指纹图谱参数信息改变，甚至有可能引起图谱直观特征形状的差异。所以，在测定非线性化学指纹图谱时，想要得到一个完整和信息量丰富以及特征性良好的指纹图谱，合适的检测用量是不得不考虑的重要测定条件之一。图2是按“1.3”测得的检测用量为0.300 ～1.500 g的龙江31号大米的图谱。
(1-0.100 g，2-0.150 g，3-0.300 g，4-0.500 g，5-0.700 g，
6-1.000 g，7-1.500 g，8-2.000 g，9-2.500 g)
图2 检测用量对龙江31号大米指纹图谱的影响
Fig.2 Influence of determing dosage on the fingerprint of longjiang 31 rice
从图2可见，根据检测用量对样品参与的非线性化学反应的电势E与时间t关系曲线中波动寿命影响的结果，可将检测用量影响E-t曲线特征信息的机理分为2个部分进行讨论。检测用量从0.100～0.500 g内，随着用量增加，样品浸出的成分浓度增大，来自样品的反应底物或耗散物的浓度也在增大，即从低于引起非线性化学反应的临界浓度或活度到超过该浓度或活度[11-12]，表现为体系的E-t曲线从不出现波动到波动寿命越来越长(见图1中曲线1～4)。而从0.500～2.500 g内，波动寿命逐渐减小，直至波动完全消失。
因检测用量增大，不仅使来自样品的底物或耗散物的浓度或活度增大，同时也使来自样品的对非线性化学反应的振荡有干扰或抑制作用的其他共存物质的浓度或活度也增大，这些干扰物质会抑制非线性化学反应，表现为抑制E-t曲线中出现的电势波动。因此，当检测用量过大时，虽然来自样品的底物或耗散物的浓度也增大，但反应体系中人工加入的反应底物的浓度不变，其活度系数则因体系中共存物浓度增大而变小，最终导致其活度变小。对于产生非线性化学反应，不仅反应的底物和耗散物缺一不可，而且这些物质在反应体系中的活度都必须大于其临界活度。任何一种反应底物的缺乏或其活度低于测定条件下的临界活度，都不会产生具有振荡现象的非线性化学反应。故在0.500～2.500 g检测用量范围内，随着用量的增加，来自样品的共存物质对非线性化学反应的干扰抑制作用越来越强，导致E-t曲线的波动寿命越来越短，直至波动曲线完全消失。
可见，样品检测用量对指纹图谱的影响尤其显著，要想获得特征性好，信息量全，反应时间不过长，而且其定量信息变化符合要求的指纹图谱，必须选好样品的检测用量。通过图2及其数据分析可知，测定大米非线性化学指纹图谱时，宜选择的检测用量为0.700 g左右。
2.3 大米非线性化学指纹图谱的重现性和特征性
龙江31和空育131两种大米的指纹图谱见图3。由图3可见，龙江31和空育131大米非线性化学指纹图谱均具有很好的重现性和特征性。因2种大米种属相近，其非线性化学指纹图谱具有相似的直观特征而与其他种类样品指纹图谱相区别。另外，尽管2种大米指纹图谱直观特征相似，但其特征参数，尤其是波动次数、波动寿命和停波时间等差异明显，故除利用系统相似度模式能准确鉴别这2种大米外，直接根据这些特征参数的明显差异也可方便快速地鉴别这两种大米(见表1)。如空育131和龙江31两种大米指纹图谱的波动次数分别是23和28左右，波动寿命分别是1 491和1 878 s左右，停波时间分别是1 932和2 288 s左右，利用这3种特征参数中任何一种的差异，都可鉴别2种大米。另外，利用指纹图谱的特征参数值计算出空育131与龙江31两种大米指纹图谱之间的系统相似度≤0.853 7，而同种大米指纹图谱的系统相似度≥0.979 9，即不同大米与相同大米的系统相似度差别显著。当用两者平均值(0.853 7+0.979 7)/2 = 0.916 8作判据，即样品指纹图谱系统相似度≥0.916 8时是同种大米，相似度<0.916 8时则是非同种大米。用该系统相似度模式来鉴别空育131和龙江31大米具有很高准确度。此外，大米指纹图谱良好的重现性也为定量分析大米二元混合体系提供了必要的条件。
图3 空育131(a)和龙江31(b)两种大米品种非线性化学指纹图谱的重现性和特征差异
Fig.3 Reproducibility and characteristic difference of nonlinear chemical fingerprints of kongyu 131 rice (a) and longjiang 31 rice (b).
表1 大米两种样品非线性化学指纹图谱的参数特征值
Table 1 The eigenvalue of nonlinear chemical fingerprints parametersof these two kinds of rices
注：限于篇幅，波动周期等因其特征值较多，从略；各种样品均平行测定3次，取其参数特征值的平均值。
2.4 大米样品非线性化学指纹图谱的相似度评价
文献指出[12]，因非线性化学指纹图谱技术采集的信号、变量函数关系等的特殊性，无论其指纹图谱共有模式、相似度计算方法等均与色谱及波谱指纹图谱有所不同。如相关系数和夹角余弦等对非线性化学指纹图谱参数的差异不敏感，不宜用来计算非线性化学指纹图谱的相似度；欧氏距离能较好体现不同样品非线性化学指纹图谱间的直观差异，但有时不能正确反映样本指纹图谱之间的特征差异的程度；而系统相似度与非线性化学指纹图谱的直观差异高度吻合，能正确体现指纹图谱之间的相似程度。
指纹图谱相似度计算可利用2种不同类型的数据[12]。一种是指纹图谱的参数信息，如色谱流出曲线中色谱峰的面积、高度和保留时间等，以及非线性化学指纹图谱中的诱导时间、波动周期、停波时间、波动寿命、峰顶和峰谷电位等；另一种是指纹图谱的相对强度信息，如各数据采集点的色谱和非线性化学指纹图谱中的相对电信号。利用前者计算的相似度叫参数型相似度，利用后者计算的相似度称非参数型相似度。用相关系数r、夹角余弦cosa 和欧氏距离d(x,y)均可计算这两种类型的相似度，其计算式分别见式(1)、(2)和(3)：
(1)
(2)
(3)
当计算参数型存在相似度时，这些公式中n表示2个指纹图谱中可比参数的数目，如色谱指纹图谱之间可比较的色谱峰面积的个数或非线性化学指纹图谱之间可比较的诱导时间、峰顶电位、峰谷电位、波动周期、停波时间、波动寿命等参数的种类数，而xi和yi则分别表示2个指纹图谱之间可比较的第i对参数的特征值。当计算非参数型相似度时，式中n表示2个指纹图谱中数据采集点的数目，而xi和yi则分别表示2个指纹图谱中第i个数据采集点各自信号的相对强度，如色谱和非线性化学指纹图谱中的相对电信号的值。非线性化学指纹图谱的系统相似度是一种参数型相似度[12]，其计算式为：
Q积
(4)
式中K、L分别表示2个比较的图谱A和B中可量化信息参数的种类数，如指纹图谱A或B中峰谷电位、峰谷时间、峰顶电位、峰顶时间、诱导时间、起波电位、停波电位、停波时间、平衡电位、平衡时间、波动幅度、最大波幅、波动寿命、波动周期、波数等信息参数的种类数；信息参数可作为指纹图谱的组成要素或相似要素，其值可看作特征值；n表示图谱A和B之间因是同一种参数而可进行比较的信息参数种类数；Sij 和Bij 分别表示2个指纹图谱之间或指纹图谱与共有模式之间第i个相似元的第 j 对可比特征值，即aij 和bij 中的较小值和较大值[8]。dij为特征权数，均可取1。不同种类的组成要素或相似要素可能具有不同个数的特征值。本研究按文献[12]方法，利用表1中列出的2种大米样品的参数特征值，以空育131大米非线性化学指纹图谱的参数值作参照，计算了该样品与龙江31大米的欧氏距离、相关系数、夹角余弦和系统相似度(见表2)。在模式识别系数中，距离系数越小或相似系数越大，则表示2个指纹图谱的相似度越高。
表2 以空育131大米的参数特征值的平均值为参照计算的两种大米样品的相似度
Table 2 Calculating similarity degree of these two kinds of rices by the average parameters of kongyu 131 rice
从表2中数据可见，相关系数和夹角余弦与指纹图谱特征差异很不敏感，不可用来对样品指纹图谱进行模式识别；欧氏距离和系统相似度均能体现2种样品指纹图谱之间的差异，如表2中同种大米指纹图谱的欧氏距离和系统相似度分别为0.000 3和0.998 8，而不同大米之间的欧氏距离和系统相似度分别为595.8和0.832 4。但前期研究结果[12]表明，在样品品种较多的情况下，欧氏距离有时不能正确反映样品指纹图谱之间特征差异的相对程度，而系统相似度系数的大小与指纹图谱特征差异的程度高度一致，故可作为根据非线性化学指纹图谱特征参数判别不同品种大米的辅助评价方法。
2.5 大米二元混合体系的定量分析
将龙江31和空育131大米按不同比例混合组成二元混合体系，测定掺杂大米百分含量对指纹图谱特征信息的影响(图4)。图4表明，大米掺杂的含量对指纹图谱的可量化信息具有规律性的影响。其中停波时间和波动寿命与大米掺杂的百分含量呈良好线性关系(图5)。由图5可见，大米中龙江31的百分比与指纹图谱的停波时间及波动寿命均成线性关系。分别将3次平行测定指纹图谱中停波时间和波动寿命取平均值(见表3)，与混合大米中龙江31百分含量进行拟合，线性回归方程分别为Y停 = 338.7X + 193 2和Y波= 351.2X + 149 1，相关系数分别为
1-9所含龙江31大米的含量分别为：0, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 100%
图4 空育131大米中掺杂不同质量龙江31大米对非线性化学指纹图谱的影响
Fig.4 Influence of kongyu 131 rice content in mixture consisting of longjiang 31 rice on characteristic information of nonlinear chemical fingerprint
以龙江31含量分别为10.0%、15.0%、85.0%和90.0%的混合大米标样测定指纹图谱来检验定量分析的准确度。根据标样指纹图谱的停波时间与波动寿命，分别利用线性回归方程Y停 = 338.7X + 1 932和 Y波= 351.2X + 1 491计算混合大米中龙江31和空育131的含量，计算结果分别列于表4和表5。结果表明，利用停波时间或波动寿命与掺杂含量之间的
线性关系均可进行掺杂量的定量分析，分析结果相对误差绝对值的平均值均≤5.14%，测定准确度较高，满足仪器定量分析要求。
表3 混合大米中不同含量的龙江31对平均停波时间和波动寿命及RSD的影响
Table 3 Influence of mixed rice content in mixture consisting of longjiang 31 rice on average oscillation stop time, average oscillation time and RSD
图5 混合大米非线性化学图谱参数与龙江31大米含量的关系
Fig.5 The relationship between mixed rice nonlinear chemical fingerprint parameters and longjiang 31 rice content
表4 利用停波时间与掺杂含量之线性关系进行定量分析的结果及其准确度
Table 4 The results and accuracy of quantitative analysis by using the linear relationship of oscillation stop time and doping content
表5 利用波动寿命与掺杂含量之线性关系进行定量分析的结果及其准确度
Table 5 The results and accuracy of quantitative analysis by using the linear relationship of oscillation time and doping content
2.6 方法灵敏度和检出限
在选定的指纹图谱检测条件下，考察了测定二元混合大米中龙江31含量的灵敏度S及检出限D。根据检出限是3倍噪声大小的有用响应信号对应的待测组分的量这一定义，以测定的停波时间的变化Δtune作为有用响应信号R(即ΔY停=Y停，混合物-Y停,纯空育131=338.7x )，以测定时偶然因素引起的有用响应信号R波动的最大幅度作为噪声N，分别计算了测定该二元混合大米中龙江31含量的灵敏度及检出限(见表6)。数据表明，测定二元混合大米中龙江31含量的灵敏度为338 s (即纯龙江31指纹图谱停波时间与纯空育131停波时间之差为338 s)；检出限为和2.66 %，即龙江31含量 ≥ 2.66 %时，测定结果具有较高置信度。当混合大米中掺杂的大米含量小于5 %时，人们习惯上将该混合大米作为纯品大米处理，即方法检出限能满足实际测定的要求。
表6 测定二元混合大米中龙江31含量的灵敏度和检出限(平行测定4次的平均值)
Table 6 Sensitivities and detection limits to determine contents of longjiang 31 rice doped in mixed rice (by 4 parallel determinations).
空育131和龙江31大米混合物非线性化学指纹图谱的停波时间和波动寿命均与各种大米含量存在定量关系，利用这些指纹图谱定量信息与各种大米含量拟合得到的回归方程，可用来预测该二元混合体系中龙江31和空育131大米的含量。该方法测定信息的变异系数≤0.49%，测定含量的相对误差绝对值≤5.14%，测定大米含量的灵敏度和检出限分别为338和2.66 %，满足实际分析要求；该方法也为其他2种不同产地或品种大米的混合物中各大米含量的测定提供了参考借鉴的手段。这对鉴别啤酒生产中是否使用优质大米和加入大米的种类及其比例提供了很好的分析手段，对啤酒生产的质量保证，防止使用假冒伪劣大米，以及对大米二元混合物的质量进行定量评价等均有重要作用。
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Abstract：Nonlinear chemical fingerprints of two kinds of rice and their mixtures were investigated by nonlinear chemical system. The analysis consists of rice components, sodium bromated, manganese sulphate, sulphuric acid and acetone. The variety of rice were identified by visual characteristics of fingerprints and system similarity pattern recognition. The content of each rice in the mixtures were determined by the quantitative information of fingerprints. The results showed that nonlinear chemical analysis can be used to identify the exact variety of rice and to accurately determine the content of each rice in the mixture. The method is simple and fast.
Key words：nonlinear chemical analysis; binary mixture; variety identification; content determination; rice
DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201611033
基金项目：国家科技部政策引导类计划资助项目(2009GJD20033)
收稿日期：2015-12-14，改回日期：2016-03-02
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