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蛋白质互作研究方法集锦

美吉生物 2020-04-04 08:55:25

蛋白质是生物功能最直接的执行者,虽然一些蛋白质可以独立的完成他的使命,但是大部分的蛋白都是需要一些伴侣分子的协助一起完成任务或者形成复合物之后才能充分发挥他的功能。所以,了解蛋白质与蛋白质之间的相互作用,能够帮助我们更好的了解细胞的生命活性,揭示隐藏在表象下的调控机理。下面我们就常用的蛋白互作研究方法进行一个总结:

经典的蛋白互作研究方法主要包括三个:酵母双杂交、免疫共沉淀、GST-pull down,你问我这三种技术是神马?听我细细道来:

酵母双杂交(Yeast two hybrid

是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究。GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域,位于N端的DNA结合域(DNA binding domain, DNA-BD)和位于C端的转录激活域(Activation domain, AD)。DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因(GAL4-responsivegene)的上游激活序列(Upstream activating sequence,UAS),并与之结合。而AD则是通过与转录机构transcriptionmachinery中的其他成分之间的结合作用,以启动UAS下游的基因进行转录. DNA-BDAD单独分别作用不能激活转录反应,但是当二者在空间上充分接近时,则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子,使启动子下游基因得到转录。

研究者基于此原理,建立了一个双杂交系统,BDX蛋白融合(X往往是已知蛋白,称作bait诱饵),ADY蛋白融合(称作prey猎物),如果XY之间形成蛋白-蛋白复合物,使GAL4两个结构域重新构成,则会启动报告基因(能显示诱饵和猎物相互作用的基因称报告基因)序列的转录。通过对报告基因的检测,反过来可判断诱饵和猎物之间是否存在相互作用。

该技术主要用来进行互作蛋白的筛选,缺点就是假阳性较高,所以需要进行结果验证,一般采用免疫共沉淀或GST-pull down实验进行验证。

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation

是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白,那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。再通过蛋白变性分离,对B蛋白进行Western blot检测,进而证明两者间的相互作用。

 GST-pull down

GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术。

其基本原理是先构建靶蛋白-GST融合蛋白载体,然后进行体外表达及纯化。将得到的靶蛋白-GSTGlutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶)融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,充当一种“诱饵蛋白”,然后将目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的蛋白,之后将目的蛋白洗脱下来,通过SDS-PAGE电泳及western blot分析证实两种蛋白间的相互作用。

以上三种方法是比较经典的研究筛选和验证蛋白互作关系的方法。但是经典并不代表没有缺陷,经典也会存在通量和创新性的限制。酵母双杂交可以大规模的筛选未知的互作蛋白,但是假阳性高,免疫共沉淀及pull down只是对已知的蛋白互作关系进行验证,不能发现新的未知蛋白。

随着蛋白质组学技术的发展,将免疫亲和与质谱技术结合产生的IP-MS技术则逐渐显示出他的优势。原理是以细胞内源性靶蛋白为诱饵,将靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行共孵育,促进免疫复合物的形成;随后加入能够与抗体结合的protein-A/G(预先结合固化在琼脂小珠上),形成”结合蛋白-靶蛋白-靶蛋白抗体-proteinA/G小珠”复合物,纯化该复合物凝胶电泳分离蛋白,应用质谱分析鉴定靶蛋白的结合蛋白。


免疫共沉淀与质谱结合,不仅能验证已知蛋白的相互作用,而且还可以鉴定与目标蛋白互作的未知蛋白,为科学研究提供全新的实验思路。

彩蛋来啦

以上是关于实验检测及验证方面的方法,大多数情况下我们初步会拿到一堆的数据,比如转录组测序筛选的差异基因,蛋白质组测序筛选的差异蛋白,想要从海量的数据里面去筛选或者初步的预测蛋白间的互作关系要怎么办呢?

其实,也有很多的软件可以帮你轻轻松松实现预测:

STRINGhttps://string-db.org/),就是一个很好的网站,既包括蛋白质之间的直接物理相互作用,也包括蛋白质之间的间接功能相关性。它除了包含有实验数据、从PubMed摘要中挖掘的结果和综合其他数据库数据外,还有利用生物信息学的方法预测的结果。

当然还有其他很多的网站或者软件,大家上网搜搜会看到很多,感兴趣的话都可以用用看。

                                 蛋白与代谢事业部 文案|王晓庆

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