清除法测定小而密低密度脂蛋白胆固醇的方法学评价及临床应用初探

冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease)简称冠心病(coronary heart disease，CHD)是动脉粥样硬化导致器官病变的常见类型。血脂异常被认为是CHD显著的致病因素，而且已广泛应用于动脉粥样硬化的防治。低密度脂蛋白胆固醇(low－density lipoprotein cholesterol ，LDL－C)升高被认为是其最重要的危险因素之一，LDL－C水平越高，危险性越大，我国和美国、欧洲等国家血脂异常防治指南中均把降低LDL－C作为主要的治疗策略。然而，近年来广泛的干预研究表明，通过降低胆固醇的他汀类药物的应用，LDL－C水平虽明显下降，使心血管事件的风险持续降低，但远没有达到理想的目标。因此，除"量"的影响外，LDL"质"的变化也逐渐引起重视。

近年来有多个研究报道指出，小而密低密度脂蛋白 (small dense low－density lipoprotein cholesterol，sdLDL)与其他类型的低密度脂蛋白(low－density lipoprotein，LDL)相比，其导致动脉粥样硬化的能力更强大，是动脉粥样硬化新的危险因素，与冠心病发生、发展关系密切。sdLDL含量测定一直是国内外学者的关注热点。目前，传统的密度梯度超速离心法、琼脂糖凝胶电泳法、质子核磁共振光谱法、体积排阻色谱法、动态光散射法以及肝素－镁沉淀法等，存在仪器昂贵、所需时间长、操作繁琐、分析速度慢等不足，无法广泛应用于临床。目前，国内已有检测sdLDL－C新方法出现，该方法基于特殊的表面活性剂和酶法，选择性与特定的脂蛋白反应，不需要任何前处理，直接在生化分析仪进行检测。本研究主要是用此新的方法检测sdLDL－C的浓度，对其检测性能进行初步评价，并探讨sdLDL－C与常规血脂项目检测的关系以及对其在急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)中的临床应用进行评估。

对象与方法

一、对象

ACS组：选择2016年4至10月在山东省立医院心内科和急诊内科住院ACS患者143例，年龄范围43～85岁，平均年龄(61.00±10.41)岁，其中男100例，女43例。将病例分为2组，其中急性心梗(acute myocardial infarction，AMI)组59例，年龄43～85岁，平均年龄(61.56±11.43)岁，男41例，女18例；不稳定性心绞痛(unstable angina pectoris，UAP)组84例，年龄45～82岁，平均年龄(60.61±9.11)岁，男59例，女25例。所有入选者符合中华医学会心血管病学分会ACS诊断标准，且经过以下标准筛选：(1)无其他心脏疾病，如心肌炎、心肌病、风湿性心脏病、先天性心脏病、合并脑血管疾病或外周血管病变等；(2)无肝和(或) 肾功能不全；(3)无影响脂质代谢的其他疾病(甲状腺功能减低、肾病综合征等)；(4)无各种急、慢性炎症、肿瘤、风湿、结缔组织性疾病；(5)近期无外伤、手术者。

健康对照组：选取2016年9至10月山东省立医院健康查体中心性别、年龄匹配的健康体检者83名，年龄范围41～ 80岁，平均年龄(59.73 ±9.80)岁，其中男59名、女24名，入选标准：所有入选者均经体检、询问病史、实验室、 影像学及心电图检查排除冠心病、高血压、脑血管疾病等疾病，且3个月内未服用他汀类等影响血脂的药物。

本研究得到山东省立医院伦理委员会批准[省医伦批第( 2017－11)]，所有受试者均签署知情同意书。

二、研究方法

1．标本采集：

所有对象均在空腹状态下(禁食8 h)采集，采集静脉血3～5 ml，1 300×g离心10 min，30 min内完成分离血清，并在2 h完成所有项目的检测。

2．仪器及试剂：

仪器采用美国Beckman Coulter公司AU5800系列全自动生化分析仪；总胆固醇(total cholesterol，TCH)(酶法)、三酰甘油(triglyceride，TG)(酶法)检测采用Beckman Coulter公司原装试剂；低密度脂蛋白胆固醇(low－density lipoprotein cholesterol，LDL－C)(直接法)、高密度脂蛋白胆固醇(high－density lipoprotein cholesterol，HDL－C)(直接法)、载脂蛋白A I (apolipoproteinA I，ApoA I)(免疫透射比浊法)、载脂蛋白B(apolipoprotein B，ApoB) (免疫透射比浊法)、脂蛋白(a)[lipoprotein (a)，Lpa](免疫透射比浊法)、超敏C－反应蛋白(high sensitive C－reactive protein，Hs－CRP)(免疫透射比浊法)、sdLDL－C检测(清除法)均采用浙江东瓯诊断产品有限公司试剂盒；非高密度脂蛋白胆固醇(non－high－density lipoprotein cholesterol，non－HDL－C)采用TCH与HDL－C检测结果的差值。

3．性能评价：

(1)精密度验证：采用2水平的厂家配套质控，分别重复检测20次，计算批内均值和变异系数(coefficient of variation，CV)；将2水平质控品分别每日检测2批次，每批间隔2 h，连续检测20 d，计算批间均值和CV。(2)准确度验证：以北京九强生物技术股份有限公司直接法检测sdLDL－C试剂作为比对方法(X)，本方法作为实验方法(Y)，收集50例患者新鲜血清，浓度覆盖线性范围，结果采用线性拟合方式，计算两种方法之间的回归方程和r2，并进行配对t检验。(3)线性验证：使用浓度为2.65 mmol/L的高值(H)和浓度为0.15 mmol/L的低值(L)样本，按照高低浓度比例分别为1H、4H＋1L、3H＋2L、2H＋3L、1H＋4L、1L的比例配置成6个系列浓度的样本，从高到低的浓度分别为2.65、2.15、1.65、1.15、0.65、0.15 mmol/L，每个浓度分别检测2次，计算平均值作为实测值，以实测均值为Y，理论值为X，使用SPSS统计软件拟合1次(Y＝aX＋b)、2次(Y＝aX2＋bX＋c)、3次(Y＝aX3＋bX2＋c)多项方程式，评估sdLDL－C在0.15～2.65 mmol/L范围内的检测是否呈线性。

三、统计学方法

使用SPSS19.0软件进行统计分析。TCH、HDL－C、non－HDL、 LDL－C、TG、ApoAⅠ、ApoB、Lpa、Hs－CRP、sdLDL－C数据资料近似正态分布，以均数标准差(±s) 表示，两样本均数采用t检验；方法学比对采用配对t检验；多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两两比较采用LSD－t检验；组间率的比较采用χ2检验；相关分析采用Pearson线性相关分析和多元线性逐步回归。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、检测性能评价

1．精密度验证：

两个水平质控品sdLDL－C的批内和批间CV分别为低水平2.60%、4.91%；高水平分别为2.85%、3.36%，CV均小于资料声明的批内和批间重复性5%和7%，说明此方法检测sdLDL－C的精密度良好。

2．准确度验证：

两种方法的线性回归方程Y＝0.984X＋0.018，r2＝0.966>0.95，说明两种方法检测有较好的相关性；配对t检验t＝－0.191，P＝0.850，说明两种方法检测sdLDL－C结果差异无统计学意义，准确度通过验证。

3．线性范围验证：

线性拟合方程Y＝1.026X＋0.007，r2＝0.999；2次多项式系数a的P值为0.123，3次多项式系数a的P＝0.070，b的P＝0.108，说明2次、3次多项式系数与"0"无明显差异，sdLDL－C检测在0.15～2.65 mmol/L范围内呈线性。

二、ACS患者血清sdLDL－C水平分析

1．sdLDL－C与其他血脂指标及Hs－CRP相关性分析：

对所有研究对象包括ACS组和健康对照组共226例，进行sdLDL－C与其他血脂指标及Hs－CRP的相关性分析。结果显示，sdLDL－C水平与TCH、non－HDL－C、LDL－C、TG、ApoB呈正相关( P<0.01)，与HDL－C呈负相关(P<0.01)，与ApoA I、Lpa、Hs－CRP无相关性(P>0.05)。详见表1。

表1  sdLDL－C与相关指标相关性分析

2．以sdLDL－C作为应变量，以年龄、TCH、TG、HDL－C、non－HDL－C、LDL－C、ApoA I、ApoB、Lpa、Hs－CRP等指标为自变量进行多元线性逐步回归分析：

结果表明，回归模型检验 F＝360.0，P<0.001，提示模型具有统计学意义。模型中变量ApoB、LDL－C、TG和HDL－C的偏回归系数均有统计学意义(P<0.05)，可见，对sdLDL－C水平有明显影响的因素为HDL－C、ApoB、LDL－C和TG。详见表2。

表2  影响sdLDL－C的因素分析

3．ACS组与对照组各指标比较：

ACS组TG、ApoB、Lpa、sdLDL－C、HsCRP水平明显高于健康对照组(P<0.01)，而HDL－C、ApoA I水平则均明显低于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，两组的TCH、non－HDL－C和LDL－C水平差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

表3  ACS组与健康对照组各指标比较(±s)

4．AMI组、UAP组、健康对照组检测指标的比较：

AMI组与健康对照组比较，sdLDL－C、TG、ApoB、Hs－CRP明显高于健康对照组(P<0.01)，而HDL－C、ApoA I明显低于健康对照组(P<0.01)，但CH、LDL－C以及non－HDL两组间差异无统计学意义(P>0.05)；UAP组与健康对照组比较，TG、Lpa、Hs－CRP明显高于健康对照组(P<0.01)，TCH、LDL－C、HDL－C、ApoA I明显低于健康对照组(P<0.01)，而sdLDL－C、ApoB和non－HDL－C两组间差异无统计学意义(P>0.05)；AMI组与UAP组比较，sdLDL－C、TCH、non－HDL－C、LDL－C、APOB、Hs－CRP明显高于UAP组，而HDL－C和TG两组间差异无统计学意义(P>0.05)。详见表4。

表4  AMI组、UAP组与健康对照组检测指标的比较

讨论

LDL是一个多分子复合物，由胆固醇酯和三酰甘油为核心，磷脂、自由胆固醇和1个ApoB－100为外壳的球状蛋白质，在密度、 颗粒大小及化学组成等方面具有明显异质性。用密度梯度超速离心法，非变性梯度凝胶电泳法将LDL按密度和颗粒大小可以分为2～15个亚组分，主要包括颗粒较小密度较大的sdLDL、颗粒较大密度较小的大而轻LDL以及介于二者之间的亚组份中密度LDL。sdLDL在动脉粥样硬化过程中发挥重要作用，并且已被美国胆固醇教育计划(National Cholesterol Education Program，NCEP)委员会成人治疗组(Adult Treatment Panel Ⅲ，ATP Ⅲ)列入新发现的重要心血管疾病危险因素之一[1]。研究表明，LDL亚型中sdLDL占优势或血清水平升高的个体，发生心脑血管事件的可能性较大。Ai等研究发现1 680例女性人群中，冠心病患者的sdLDL－C平均水平明显高于非冠心病者，而两组的LDL－C水平没有明显差异。Nishikura等对190例冠心病患者连续观察7年，结果发现sdLDL－C水平较高的患者，预后较差。Shen等研究了sdLDL－C与动脉狭窄的严重程度的关系，实验结果表明，动脉狭窄越严重，机体sdLDL－C水平越高。sdLDL是LDL促动脉粥样硬化发生发展的主要亚型，可作为冠心病的独立危险性预测指标，其预测甚至优于传统的危险因素指标。

近年来，sdLDL越来越引起临床和实验室的高度重视，但是目前传统的检测方法都存着不足，难于常规检测，该项目一直无法广泛应用于临床。本方法采用两步直接清除法，第一步利用试剂1适量的非离子表面活性剂在胆固醇氧化酶胆固醇酯酶、过氧化氢存在下消除非sdLDL成分，然后利用余下的sdLDL－C与胆固醇酶试剂反应显色。此方法不需要任何预处理，并且可以在全自动生化分析仪进行检测。这些特点适合于大规模的临床研究。本研究对直接清除法检测sdLDL－C的试剂盒进行了初步的性能评价，结果表明，其精密度、准确度和线性均符合检测要求，可以应用于临床标本的检测。

LDL亚类是从肝脏从极低密度脂蛋白(very low－density lipoprotein，VLDL)向中间低密度脂蛋白 (intermediate low－density lipoprotein，IDL)和LDL颗粒转化的去脂过程中产生。Berneis等提出sdLDL代谢有两种不同形式：第1种受肝脏合成TG的影响，当肝脏合成TG减少时，肝脏主要分泌释放小颗粒、富含TG的VLDL1和含TG少的IDL2入血，当肝细胞合成TG多时，肝脏释放颗粒大、含TG高的VLDL1和含TG少的VLDL2入血，经过肝酯酶和脂蛋白脂肪酶的作用后，富含TG的VLDL1内的TG逐渐被水解，形成sdLDL，而VLDL2被水解，主要形成大颗粒LDL；第2种受血液中TG影响，当血液TG增高时，LDL总量未变，但在胆固醇酯转移蛋白作用下，VLDL中TG与LDL、HDL的胆固醇酯交换增加，生成的sdLDL增多。本研究做了sdLDL－C水平与TCH、HDL－C、non－HDL－C、LDL－C、TG、ApoB、ApoA I、Lpa等常用血脂指标以及Hs－CRP的相关性分析，结果显示sdLDL－C与TCH、non－HDL－C、LDL－C、TG、ApoB呈正相关，与non－HDL－C、LDL－C、ApoB的相关性较大，相关系数均大于0.800，与TG相关系数为0.514；与HDL－C呈负相关，与Lpa、ApoA I、Hs－CRP无相关性。这与Koba等利用肝素－镁沉淀法检测sdLDL－C水平得到的结果基本一致，并不像其他研究显示的与TG的相关性最高。以sdLDL－C为应变量的多元逐步回归分析显示，对sdLDL－C水平有明显影响的因素依次为ApoB、LDL－C、TG和HDL－C，与sdLDL的代谢过程基本一致。高水平sdLDL－C可以综合反映高LDL－C、高TG和低HDL－C等血脂代谢异常，避免单独以LDL－C、TG或者低HDL－C作为治疗靶点的片面性。研究证实，CRP直接参与动脉粥样硬化斑块形成过程，间接参与动脉粥样硬化及内皮细胞炎症的发展。低水平的Hs－CRP反映了动脉粥样硬化斑块损伤的炎性本质，可以被视为心血管风险评估的指标，遗憾的是我们没有发现sdLDL－C与Hs－CRP的相关性，提示sdLDL在致动脉粥样硬化过程中，与Hs－CRP的致炎性机制不同。

动物体内及离体实验表明，sdLDL比LDL具有更强的致AS作用。其作用机制如下：(1) sdLDL颗粒小，易进入动脉壁内，并被动脉壁内的巨噬细胞吞噬；(2)另外，其颗粒表面抗氧化成分减少，容易被氧化成氧化修饰型低密度脂蛋白，使其在血浆中停留时间延长，进入血管壁内后易被巨噬细胞摄取；(3)富含TG的sdLDL中ApoB与ApoB受体结合力降，而不易通过LDL受体途径在循环中被清除，sdLDL颗粒与动脉内膜上蛋白聚糖亲和力增强，被黏附于血管壁易进入血管内皮细胞；(4)sdLDL有很强的促进炎症细胞分泌炎症因子，在动脉粥样硬化斑块形成，特别是不稳定性斑块形成中起重要作用。ACS作为冠心病的一种严重类型，主要是冠状动脉粥样硬化基础上斑块不稳定、发生破裂引起冠状动脉阻塞病变为病理基础的一组临床综合征，其发生与持续存在的炎症刺激有关，炎症反应促进了动脉粥样硬化的发生和发展。虽然高胆固醇血症是一个CHD既定的风险因素，但在ACS患者中LDL－C浓度也不一定总是升高。此外，Tashiro等报道，不稳定性心绞痛患者的LDL－C浓度反而低于稳定心绞痛患者。并且在LDL－C相对较低情况下，他汀类药物治疗可以有效的降低ACS患者心血管事件发生或斑块的体积。本研究显示ACS患者sdLDL－C、TG、ApoB、Lpa及Hs－CRP水平明显高于对照组，HDL－C、ApoA I明显低于对照组，而TCH、LDL－C、non－HDL－C两组之间无差别。AMI组、UAP组、对照组两两比较发现：Hs－CRP浓度AMI组>UAP组>对照组，反映了3组之间冠状动脉炎性反应程度和损伤程度[28]；AMI组和健康对照组TCH、LDL－C水平水平相近，均高于UAP组；而AMI组sdLDL－C水平明显高于UAP组和健康对照组，UAP组虽然略高于健康对照组，但是差异无统计学意义；其他指标如non－HDL－C、TG、ApoB、Lpa的组间比较差异均有统计学意义，但与sdLDL－C的趋势并不相同，说明血脂代谢是一个复杂的过程，sdLDL－C水平独立于TCH、LDL－C和TG等常规血脂指标，与ACS的发生、发展及病情严重程度密切相关，可以作为一个ACS独立危险因素指标和预测指标，应用价值优于目前血脂控制的主要靶标LDL－C。

综上所述，sdLDL与人体血脂代谢异常存在密切联系，是评估机体脂质代谢情况的良好指标。利用直接法测得的sdLDL－C性能良好，对冠状动脉粥样硬化的危险程度具有很好的评价作用，是对目前临床常用血脂检测指标的补充，其临床应用将进一步加强对血脂的认识。本研究方法操作简单、无需特殊实验设备，可对大量样品进行快速、准确的定量检测，具有较好的临床应用价值。

此篇文章属于转载文章，来源：中华检验医学杂志, 2017,40(4) ，作者：成士清、鞠瑛、栾芳、徐艳秋、鲁真真、卢志明、张炳昌。若有侵权或转载限制请联系我们（或在公众号下方留言），我们将第一时间联系您并进行删除。

转载：检验科空间