【你真的了解外泌体吗?】系列之——外泌体鉴定

看到前面外泌体分离方法的介绍，小伙伴定会疑问：怎么知道我分离得到的是以外泌体为主的细胞外囊泡呢？是否有外泌体较典型的结构？是否表达其特异性表面Marker？大小是否落在外泌体常规的粒径范围？这，就需要我们对分离产物进行鉴定。

去年底，国际细胞外囊泡研究协会（ISEV）再度重申了2014年协会发布的囊泡研究所需的最少实验要求（minimal information for studies of EVs，简称MISEV），并且发布了针对MISEV2014的问卷调查，用意是来规范针对囊泡的学术研究，提高可重复性。具体要求如下图：

文中以较大篇幅强调了囊泡鉴定的重要性，无论哪方面的囊泡研究，囊泡鉴定工作是必要基础，只有保证囊泡分离及鉴定的质量才能够确保结果的可信度及重复性。

根据上述要求，我们可以将囊泡鉴定拆解为三部分：

1. 蛋白鉴定：Western Blot或流式细胞术

2. 粒径分析：动态光散射(DLS)或纳米颗粒跟踪分析(NTA)

3. 形态表征：透射电子显微镜（TEM）或原子力显微镜（AFM）

一般情况下，研究者会综合运用各种检测手段来对分离物进行最终鉴定，而在这些手段中，外泌体透射电镜观察、外泌体粒径分析（NTA）以及外泌体表面标记蛋白western blot都是非常关键的技术，是外泌体表征鉴定方法的“金标准”。

透射电子显微镜

透射电子显微镜观察法是从形态和大小上对外泌体进行鉴定。通过负染的方法，在高倍放大下直接观察单个外泌体的形态结构和大小。

检测原理：透射电镜将经过加速和聚焦的电子束投射到非常薄的样品上。电子与样品中的原子碰撞后会产生立体角散射。散射角的大小与样品密度、厚度相关，因此会形成明暗不同的影像。该影像经过放大、聚焦后在成像器件上显示出来，以供观察。由于电子的德布罗意波长非常短，分辨率可达纳米水平，非常适合用于外泌体的结构及形貌表征。

结果展示：

NTA粒径鉴定

粒径分析是从整体上对外泌体大小分布情况进行检测，具有准确、快速、可重复性好等优点，是对现有外泌体鉴定方法的良好补充。

检测原理：zetaview 采用激光光源照射纳米颗粒悬浮液，并对纳米颗粒的散射光进行检测，通过统计散射颗粒的数量来计算纳米颗粒浓度。同时，追踪纳米颗粒布朗运动的轨迹（NTA），进而计算出单位时间间隔下纳米颗粒的均方位移（MSD），并根据NTA结果得出纳米颗粒粒径分布图。测量范围：0.01-3 μm*（直径）。

结果展示：

Western Blot

Western blot是通过抗原抗体特异性结合的原理，对外泌体标志蛋白进行检测，从蛋白质组学方面对外泌体进行鉴定。常用的外泌体标志蛋白包括CD63、CD81、TSG101及ALIX等。

检测原理：对外泌体表面蛋白标记物CD63、TSG101以及外泌体阴性标记物Calnexin进行Western blotting检测。若待测样本检测到CD63和TSG101蛋白，则说明样品符合外泌体特征。

结果展示： 

Get到新技能，就赶快回家鉴定一下分离的细胞外囊泡是个什么情况吧。如果觉得操作繁琐复杂，没关系，一个电话，小恩帮您来定……

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