基因和细胞疗法之基础保障--质粒DNA生产

基因疗法理念毋庸置疑，最早的研究始于20多年前。然而在过去的几年里，对于这一领域的关注点，从最初的利用病毒载体的再生方法，逐渐转移到利用重组病毒载体对T细胞进行修饰的免疫疗法的应用上。这种疗法是以利用腺相关病毒（AAV）或慢病毒为基础的。这两种载体通常以质粒DNA作为起始材料，通过瞬时表达路径生成。

病毒载体都是由两个，三个或四个质粒组合而成，且每个载体含两个或三个结构性/辅助性基因和一个单一治疗性转基因。他们随后选择性的被用于生产病毒载体。（见图1）

普遍认为, 为满足大量患者的需求，改良T细胞的大规模生产将会使科学、技术和成本方面面临更多挑战。这些产品的进程将生物制造业推向了一个新的复杂层面-----这将由被要求生产出来的生物实体（通过重组路径而生产的）的数量来说明（见图2）。

随着临床成功的级别不断提升，以及产品在进入后期临床研究阶段上的进步，行业对质粒DNA的需求量不断上升，实现其大规模生产势不可挡。同时，随着越来越多的患者使用到这些类型的产品，。长远来看，当这些类型的临床方法继续展现出积极的临床研究成果，药品研究人员将会不断地需要‘为成功而作计划’，以及制定长期的生产策略用以支持产品进入到后期临床阶段以及入市之后的供给。

许多公司意识到，需要对细胞疗法的生产方法自身以及在很大程度上对病毒载体生产工艺流程进行重大改变，以满足后期临床实验和市场对成功产品的需求。毫无疑问的是对质粒DNA的大量生产需求将会继续增加。为了满足不断增加的需求量，生产平台需要进行重大规模的升级改造。也许小规模生产平台小于10g/批次的产量能够满足小于10000名患者所需的细分疗法的需求。但更合理的预测认为对于市场化的产品而言，每种质粒载体所需要的产量为100-1000g/每年。

材料需求量的增加意味着，必须建立路线图来指导应对生产病毒载体和质粒DNA过程的变化。这些指导同样需要在安全性和功能性问题上进行验证比较。

更进一步，随着产品在临床阶段的进步，开发人员必须建立一条稳固的供应链。良好生产操作规范（GMP）指南中就建议要建立后备供应体系，以满足后期和入市之后产品所需的材料供应需求。如果是质粒DNA的话，那它可能不仅仅涉及到来自不同供应商和设备的采购材料，而且还包括不同的生产工艺。

供应链管理的责任显然由药物研发人员和最终负责产品质量的临床试验赞助方承担。这些组织必须为早期临床评估，以及建立路径图以满足后期阶段的临床研究和市场调研的需求提供材料。

当我们还在关注为早期临床试验阶段提供质粒的方法时，显而易见的是许多公司正在使用高质量质粒DNA。2005年EMEA在关于‘慢病毒载体的生产与开发’指导方针中指出，有必要在慢病毒载体的生产中使用高质量DNA，并要求为每个质粒和转移载体包提供完整的基因序列。然而，在质量体系或者制造方法方面，并没有真正具有指导意义的文件为这些高质量产品提供意见。而且他们中也有很多不符合GMP的准则。包括我公司在内的供应商，均可在这项领域中提供的服务。每一个供应商都有自己的方案，来完成原材料、消耗品、环境控制，以及包括完整性序列在内的最终产品测试的可追溯条件。

高质量质粒目前仅用于早期阶段的“原理论证”的少数患者（＜20）研究上。但如何在获得成功的产品和增加患者数量方面取得进展并没有获得广泛关注。这一问题，因“基因治疗药物的质量、非临床和临床方面”而变得更加复杂。在其他提到的产品中，质粒DNA作为一种GMP级的“启动材料”，必须来源于细胞库并在“GMP准则”条件进行生产。然而正如对“高质量”术语理解一样，对 “GMP准则”的理解具有开放性，同样对两者的要求的理解也是不同的。显而易见的是一些大型公司已经全面采取了GMP标准的方法，甚至在包括1-2a阶段临床材料供应上，而相比之下其他产品的开发团队所采用的则是不那么严格的方法。很明显，这些最新的指导方针将进一步推动ICH指南在基因治疗产品和体外病毒载体模式等方面的应用。

将质粒作为起始物质进行分类是不足为怪的，因为质粒为蛋白质分子提供了启动遗传密码，从而实现了理想的治疗效果。由于编码错误的影响，可能会在病人安全和治疗后果方面面临挑战。就起始材料而言，MHRA2015指导方针表明：、生产工艺、供应链复杂性以及材料在医药产品中的最终用途所带来的风险成比例。这些指导方针可能在建立质粒生产的质量控制方法时，成为一个有效的切入点。

GMP的严格程度随着临床阶段的要求而不断提升。PDA56号技术报告“合适的质量体系和CGMP在治疗蛋白药物产品物质开发中的应用”，为许多传统生物制品和药物开发人员提供了很多的指导。该文件列举了四个具体的领域：品质体系，设施，设备，材料和实验室，方法上的区别主要在阶段2，这些的区别则在阶段2和阶段3。由于许多细胞和基因治疗产品不太可能进入到经典的第一阶段的安全研究中，因此需要根据病人的数量和相关风险（包括那些因同情使用而产生的风险）进行评估。

指导方针同时还为早期阶段的研究确定了不同组织结构和能力认定：

1.大型制药/生物技术公司可能将产品带入市场。

2.将产品开发到阶段1 - 2，然后转移到到大型企业（组织），或者与大型企业合作开发。

3.大学和资助机构为发表科学论文进行小型试验。

现如今，许多基因治疗研究都是由大学和医院团体赞助的，但是这种情况正在迅速改变。

在早期的临床评估中，与学术团体合作的大型制药公司和资金充足的初创公司的界线正变得越来越模糊。质量体系的方法需要以风险为基础，并需要对起始原料的属性特征、背后的制造过程，以及产品的预期用途有所理解。在质粒DNA的项目中，制造业总是将内部平台流程外包给专业制造商。在这种情况下，（如果有的话）会预先开展一些有限的特定质粒载体生产方面的开发研究。相反，赞助方依靠的是知识和生产商对自己生产平台的理解而不是为特定的质体产品获得知识。显然，到目前为止，供应商的选择标准是基于成本花费和其风险可行性。

从技术角度而言，用于临床级别的质粒DNA的生产流程都很相似。（图3）

在质粒DNA的绝对起始点这个问题上，，但最初的质粒结构被用于生产制造细胞库。质粒DNA的特性与其完整性和稳定性不仅对产品的未来发展至关重要，而且还为制造病毒载体和实现预期疗效提供基础。

通常，质粒的核心部分被作为起始材料提供给DNA生产商，这些质粒本身由药物开发人员通过培养K12-E coli生产菌株来获得。克隆是在最基本的评估和细胞库建立之前开始选择。ICHQ5D准则，其中一项关于细胞库的要求就是在工艺条件下，要能证明质粒的稳定性（包括质粒损失、分离纯化损失）和传代调整的影响。诸如这样的事件在病毒载体中经常发生，可能还需要对质粒进行重新设计。

在根据GMP准则评估质粒结构和细胞库时，会发现FDA和EMEA有许多关于结构、制造和测试要求的指导方针。指导方针包括关于使用抗生素标记基因的建议，例如避免使用氨苄青霉素；FDA和EMEA均对不含抗生素的系统格外青睐。

尽管一些开发人员选择不对早期临床阶段GMP细胞库进行全面测试，但更换的细胞库必须由被视为GMP细胞库的方法来生产，并利用现有研究细胞库来支持后期临床试验。

发酵过程，往往是非常相似的，通常以fed - batch模式运行。特别是在后期和大规模的处理加工中，通常不添加抗生素，并按照行业操作惯例使用化学介质。收获发酵过程中产生细胞浆，并通过碱性裂解从细胞浆中提取质粒。处理过程中，制造商使用细胞溶解专利技术来提取质粒DNA，往往是过程差异所在。准确地说，不同的方法对产品质量和性能的影响不仅很难评估，且在科学文献中也没有报道。

纯化过程通常结合离子交换以及疏水层析进行，在某些情况下，还包括凝胶渗透色谱法（分子体积排除色谱法）。这些过程里利用IEX移除内毒素和RNA残留物，用HIC清除宿主DNA，并重点分离开环和闭环质粒。这些过程中还可能包括利用沉淀法清除宿主RNA。

目前大多数药品研发公司的注射用DNA疫苗都是基于FDA 2007指导方针的要求，（1）（参照FDA指南），闭环DNA量通常能到达90%的超螺旋，这比文件中规定的80%要高。尽管分析程序有所不同，但在测量残差方面，都采取了相当标准的方法。质粒形式用不同的方法检测，一些组织倾向于使用基于HPLC的程序，而另一些则倾向于基于CE的方法。

这些指导方针中，均未能涉及到对强效性和功能性这一领域的衡量。尽管质粒超螺旋层通常被认为是质粒功能性和稳定性以及病毒载体转染能力的代表物，但是没有多少证据持续支持这种联系。因此，要确定用于制造病毒载体的质粒的关键质量属性是具有挑战性。很明显，为了满足未来的潜在需求，随着制造程序的发展这将是至关重要的。同样我们还需要确定那些次关键性属性。

对于关键质量属性的理解将变得越来越重要。随着制造商寻求实现所需的制造规模和过程灵活性的方法，同时将产品成本水平(CoG)也控制在可接受的范围内，就需要对质粒生产过程和规模进行改变。例如，目前的期望是对材料进行纯化，以降低残留污染物而达到可注射产品的水平。这与一些公司采用慢病毒生产的方法是相反的，因为在细胞治疗产品中，只采取有限的纯化以除去宿主污染物。是否可以采取类似的方法简化质粒DNA纯化过程?还需要考虑制造设施的设计。是否需要在高级别的净化室中或者在较低的分类套件中依赖于封闭系统的方法生产这些产品，是否通过固定的或者单一的设施来生产呢？

在质量体系方面，我们可能还希望验证过程的各个方面。如果质粒可通过基于平台的方法（包括纯化验证、提取的风险评估和一次性过滤系统）生成，那么我们是否可以验证这个平台可用于多个产品而不是单个产品的生产？

展望未来，我们将寻找制造质粒的新的替代方案。用于制造小型DNA片段的合成生产工艺，例如Touchlight 开发的Doggybone DNA(dbDNA)平台，也许可用于生成病毒载体。在非常早期的开发阶段，它们可能会简化生产过程。这也表明，这些可能被认为是化学的(而不是生物实体)小的DNA片段，是具有完全特征的。

为满足每个病毒载体需要2到4个质粒进行构造，以及质粒在临床试验和市场产品中的各种疗法的潜在需求，供应链管理将越来越重要。此外，几乎所有的质粒DNA制造都被外包给专业制造商和CMOs，因此，制药商必须向这些供应商寻求长期解决方案，以应对未来的市场需求。这包括确定适当的基于风险的制造方法，以及支持开发、投资所需的能力和制造能力。为确保供应的完整性，它还需要灵活的方法，而不是固定在任何单一的平台上，特别是对于入市的产品。条件允许的情况下，未来很可能采取替代方法来满足对质粒的需求。

随着基因和细胞治疗产品的增多，我们正处于非常有利的时期。企业寻求机会将它们推向市场时，也将寻求方案解决生产制造中出现的挑战。很明显，我们需要重新唤醒行业对质粒生产平台（包括新方法在内的）的投资。此外，质量体系需要更高的透明度，以支持和指导这些可改变生命的新疗法所需的投资和发展。

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