摘在生态毒理学受试生物研究上，国内外已经开发了多种受试生物品种，如斑马鱼，大型溞，浮萍，虹鳟，牡蛎，稀有鮈鲫和青鳉等[135-141]，但是关于淡水双壳类底栖生物的报道很少，河蚬作为中国本土的底栖物种，分布广，敏感性强，易取样，能直接反映水污染现状。 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息，为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术，克隆典型河蚬肠促胰酶肽（Cholecystokinin），Conopressin神经肽和FF神经肽基因，并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯，筛查敏感的神经肽标志物，为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制，为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。 图1-1 本论文的技术路线 第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种，陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因，如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。 因此在本研究中，我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况，两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标，本研究提供了河蚬miRNAs数据，为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。 2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖，养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取，然后在3’和5’接头加上测序序列，接着进行反转，建库，PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA，加接头，最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤，评估序列质量去除低质量序列和3’接头，5’接头和多A序列，计算小RNA长度分布[143, 144]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA，tRNA，snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定新miRNAs：碱基的数量为18到24，自由能≤-20 kcal/mol，并且miRNA从一个前体端产生。Solexa测序在牡蛎比对中形成miRNA: miRNA*对被认为是miRNA*。 2.2.4 miRNA的鉴定与表达分析 为了鉴定深度测序获取的miRNAs，我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs，以5S rRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织中的表达情况，总RNA使用miRcute miRNA First-strand cDNA Synthesis Kit (TianGen, China)试剂盒来提取，定量液使用miRcute miRNA qPCR Detection Kit (SYBR Green; TianGen, China)，定量仪使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Life Technology, USA)，定量引物使用miRprimer软件[146]设计，见表2-1。 表2-1 河蚬miRNA定量使用的引物 miRNA forward primer(5’→ 3’) reverse primer(5’→ 3’) 5s rRNA aagttaagcaacgtcgagccc ttagcccagttgttaccagca cf-miR-1985 cagtgccatttttatcagtcac ggtccagtttttttttttttttacag cf-miR-12 cgcagtgagtattacatcaggt ggtccagtttttttttttttttcagt cf-miR-216a cgcagtaatctcagctggt ggtccagtttttttttttttttcagaa cf-miR-216b cgcagtaatatcagctggt gtccagtttttttttttttttcagga cf-miR-67a gcagacaacctgcttgaatg ggtccagtttttttttttttttcct cf-miR-184 cagtggacggagaactga ccagtttttttttttttttgccctt cf-miR-10 gcagtaccctgtagatccga aggtccagtttttttttttttttacaa cf-novel-14 tggcactggcggaa ggtccagtttttttttttttttgtga cf-novel-2 cagacactgcgatctattgag gtccagtttttttttttttttcttagtc cf-novel-18 tgccctatccgtcagtc gtccagtttttttttttttttgcag cf-novel-31 gagctgcctgatgaagag tccagtttttttttttttttggaca 2.2.5 目的基因预测分析 John等[147]报道过的目的基因预测方法。尽管河蚬基因组和EST序列缺乏，但是有4个环境相关的基因全长(gst-pi, hsp70, cyp4 and metallothionein)可以从ncbi上获得，使用miRanda [148]和RNAhybrid [149]对miRNAs和这四个基因的3’非翻译区作了目标预测。 2.3 结果与分析 2.3.1 miRNA序列分析 我们使用河蚬外套膜，肌肉，消化腺，性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息。过滤掉低质量的和接头序列，清楚污染的和短序列后，我们获得了28,799,934条高质量的reads。这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组。得到了代表39813个序列的6194289个高质量reads（表2-2）。去除掉rRNA, tRNA, snoRNA和其他ncRNA序列，剩下的4995304 reads（代表16144个 不同的reads）被用来预测保守的和潜在的新miRNAs（表2-2）。不同类型的小RNAs的数量和比例如表2-2。 尺寸是一个重要的特征用来区分miRNAs和其他小RNA[150]。miRNAs的尺寸一般是18到24bp[151]。本次研究的小RNAs的尺寸分布如图2-1。我们发现绝大多数是22bp，占了总reads数的14.4%。同样地，在斑点叉尾（25.8%）[143]和珍珠贝中（34.48%）[29]也是22bp的最多。 图2-1 高质量reads长度分布 表2-2 河蚬中不同类型小RNAs长度分布 Small RNA Unique RNAs Percent (%) Total RNAs Percent (%) Total 39,813 100 6,194,289 100 rRNA 11,262 28.29 1,048,538 16.93 tRNA 2,124 5.33 22,289 0.36 snoRNA 19 0.05 183 0.00 other 10,264 25.78 127,975 2.07 miRNA 16,144 40.55 4,995,304 80.64 2.3.2 河蚬保守miRNAs确定 为了确定河蚬保守的miRNAs，我们将测序数据比对到在miRBase 21中的后生动物miRNAs库，允许有1到2个错配碱基[152]。总共16144个唯一的序列被比对到数据库。属于35个miRNAs家族的45个保守的miRNAs被鉴定出来（附录4）。此外，这些结果显示有26个保守的miRNAs超过1000测序数。miR-10测得1304866个拷贝数，是最多的，紧接着是miR-184（258355），miR-315（220094）和miR-7（144322）（附录2）。在这些保守的miRNAs中，15个只有低于100个拷贝数。miR-67a和miR-67b只被检测到1次。 2.3.3 河蚬新miRNAs的鉴定 因为河蚬基因组信息未知，所以我们使用牡蛎基因组和河蚬EST数据库用来预测新miRNAs[153]。44个符合规则的小RNAs被认为是潜在的新miRNAs。它们二级结构的自由能从−20.10到−99.00 kcal/mol（附录3）。有28个新miRNAs被检测少于100个拷贝，15个新miRNAs少于10个拷贝。预测的5个表达最高的miRNAs的二级结构如图2-2。 图 2-2 5个表达最高的新miRNAs预测二级结构 2.3.4 河蚬miRNAs的荧光定量 为了检测河蚬潜在miRNAs的组织分布，我们使用荧光定量PCR检测不同miRNAs在不同组织中的表达水平。特别地，4个新的(Novel-2, Novel-14, Novel-18 and Novel-31)和8个保守的(miR-10, miR-12, miR-67a, miR-184, miR-216a, miR-216b, miR-1985 and miR-1992)（图2-3）miRNAs被检测了表达水平。 结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高，然而miR-10和Novel-2在鳃和内脏团中表达量最高。此外，miR-1992在所有组织中表达相似。广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[154]。相比较而言，一些miRNAs高度显示了组织特异性。miR-67a和miR-1985在腹足中最高，接着是外套膜，鳃和内脏团。此外，我们发现miR-12主要在腹足中表达，然后依次是内脏团，鳃和外套膜。miR-216b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少。而且，miR-184和miR-10表达水平在鳃，腹足和外套膜中几乎一样，在内脏团中明显低。而在新miRNAs中，Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富，在 鳃和内脏团表达量低。Novel-31在腹足中表达量最高，接着是外套膜和鳃，而在内脏团中非常低。Novel-2在鳃中很少表达，但在腹足外套膜和内脏团中表达高。 图2-3 8个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中（鳃，腹足，内脏团，外套膜）的表达水平 2.3.5 河蚬miRNAs目的基因的预测 为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能，我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系。miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件，这款软件允许G=U假阳性，这在预测RNA:RNA复合体很关键[155]。可以用于人，老鼠，苍蝇和蠕虫的序列预测[156]。相比较而言，RNAhybrid是一款简单，快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[156]。这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点，能计算杂交结构自由能。 结果显示所以的环境相关基因都有相应的miRNA作用（表2-3），metallothionein基因是miR-7的目标。miR-1992，miR-2b和Novel-40可能与调控 河蚬hsp70有关。我们的结果还显示miR-10和miR-1992可以作用于cyp4的3’非翻译区。然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集。图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的交联关系。 图2-4 miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的关系 表2-3 miRanda和RNAhybrid预测的河蚬miRNAs与gst-pi, hsp70, cyp4和metallothionein的关系 Genes (gene ID) miRanda RNAhybrid Conserved Novel Conserved Novel gst-pi(AY885667.1) miR-315, miR-8a, miR-8b Novel-30, Novel-38 miR-277 Novel-1*, Novel-4 hsp70(KJ461738.1) miR-1992, miR-2a, miR-2b, miR-2c Novel-40 miR-1992, miR-2b, miR-34, Novel-29, Novel-40 cyp4(JQ678818.2) miR-10, miR-1992, miR-315 Novel-30, Novel-15, Novel-23, Novel-36 miR-10, miR-1992, miR-1994, miR-263, miR-285a, miR-285b, miR-34, miR-7 Novel-1*, Novel-14, Novel-17, Novel-29, Novel-3, Novel-4 metallothionein (EF185126.1) miR-1985, miR-315, miR-7, miR-7, miR-981 Novel-20, Novel-29, Novel-31, Novel-6a, Novel-6b, Novel-8 2.4 讨论 我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据，并进行了分析。发现保守的miRNAs表达比较高。之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同物种间是保守的[157]。miR-10在河蚬中是表达量最高达，文献报道它能抑制斑马鱼HoxB1a and HoxB3a基因[158]，David Hassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[159]。而且在其他几个物种中发现miR-10能与一系列Hox 基因共表达，能调控Hox 转录本的翻译[160]。这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础。Xu等[161]报道了牡蛎中miR-216b主要在消化腺中表达，接下来是鳃和外套膜。Wong等[162]研究发现miR-184的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[162]。组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达，仅有少数miRNAs在多组织中高度表达。 河蚬新miRNAs的表达量低， 在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于100次[29]，此外，25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大于1000，绝大多数测序数小于100[163]。我们的结果与之前的研究是一致的[164, 165]。新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用。 2.5 本章小结 在本研究中，我们使用Solex深度测序总共从河蚬小RNA库获得28799934条高质量序列。鉴定了45条保守的和39条新的河蚬。使用荧光定量PCR验证了8个保守的和4个新的miRNAs，发现它们在4个组织中表达各有差异。此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系。本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础。 第三章 河蚬CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 3.1 引言 目前，人，老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟，无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗牛，牡蛎，章鱼等海洋软体动物，没有淡水双壳类动物的文献报道，神经肽的毒理学研究也很少，开发河蚬典型神经肽标志物，并应用于毒理学研究十分必要。本研究选取了CCK,Conopressin和FFamide神经肽作为研究基因。 本章以转录组测序获取的神经肽片段为参考，运用RACE技术，成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的全长，对全长序列进行了生物信息学分析，使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布，并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响，筛查了神经肽标志物。 3.2 材料与方法 3.2.1实验材料 3.2.1.1 试剂 TRIzol购自Invitrogen(USA）公司；荧光定量PCR试剂盒、琼脂糖、M-MLV试剂盒、Oligo-(dT） 18、DNase I和dNTP购自Promega（USA）公司；100 bp 和 2000 bp ladder购自天根生物（北京，中国）公司；SMART RACE cDNA amplification kit 购自Clontech(USA）公司；TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit, pMD20-T vector 和E.coli JM109 感受态细胞购自TaKaRa(Dalian, China）公司； ，异丙醇和无水乙醇都是国产分析纯。 3.2.1.2实验仪器 Centrifuge 5804R离心机(eppendorf, USA） PowePac Basic电泳仪(BIO-RAD, USA） Gel Doc XR+凝胶成像仪(BIO-RAD, USA） 梯度热循环仪（Veriti thermal cycle system）（Life Technologies，USA） Multiskan GO 酶标仪（Thermo Scientific，USA） 荧光定量 PCR 仪7500 Real-Time PCR system（Life Technologies，USA） 3.2.1.3统计分析与绘图软件 SPSS16.0 软件，Origin8.0软件 3.2.2河蚬的实验室养殖 河蚬购自洪泽湖，在盱眙县老子山镇洪泽湖码头采集，壳长在1-3cm 左右，年龄在1-2龄左右。带回实验室用恒温养殖系统进行驯养。采用流水养殖，建立一套恒温的流水系统进行养殖，选用水泥池流水循环系统养殖河蚬，以水泵提供流水动力，建有过滤池和养殖池，水经过水泵从过滤池传送到养殖池，再流回过滤池进行过滤。池底铺粒径为0.5 mm左右的细沙，所用水为500目纱绢过滤并充分曝气的自来水，室内温度使用空调控制，水温保持在20±1ºC，水质硬度在250mg/L以下, 光照周期为12h：12h，饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻，或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料。河蚬实验室养殖规范见附录1。 3.2.3 RNA 提取和 cDNA 合成 3.2.3.1. RNA 提取操作步骤： 河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法，在无菌和无RNA酶的超净工作台进行，具体操作步骤如下： (1)取50-100mg河蚬组织迅速放入预冷的1.5 ml EP管，迅速加入200-300μL冰预冷的Trizol液，然后用电动棒碾磨均匀，接着加入冰预冷的800μL Trizol液，注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%，室温放置5min，使其充分裂解。 (2)以每1mlTrizol液加入0.2ml 的比例加入冰预冷的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15 秒，室温放置3 min，然后放入离心机，4℃，12000转，离心15min，吸取上层水相，尽量不要将沉淀吸入，移至另一1.5mLEP管中。 (3)每管加入500uL冰预冷的异丙醇混匀，室温放置10min。 (4)12000 g，4°C，离心10 min，弃上清，此时RNA沉于管底。 (5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇，用手轻轻上下翻转约50次，用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。 (6)8000 g，4°C下离心5min，尽量弃上清。 (7)室温瞭干，注意不要干燥过分，然后将RNA 溶于无核酸水中。利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时，样品纯度符合要求，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 中的 DNA （1）用 RNase-free DNase 去除样品中DNA污染。 DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL） RNA 16μL DNaseⅠ 2 μL 10×DNaseⅠ Buffer 2μL Total volume 20 μL （2涡旋混匀后，37°C 水浴 30min。 （3）加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL，混匀，瞬时离心，65°C 反应 10min。 （4）RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于1.8，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量，使用Promega的M-MLV反转录系统。主要步骤如下： （1）在一支无核酸酶污染的小离心管中加入2μg总RNA，2μg随机引物和去离子水一共15μL，在金属浴中加热离心管到70℃，5min，这样可以打开模板的二级结构。然后立即在冰上冷却，以避免重新形成二级结构，短暂离心，使溶液归于管底； （2）按照下列表格的顺序和比例在上个步骤的离心管中加入反应体系的各个组分： M-MLV 5X Reaction Buffer 5μL dNTP混合液 1.25μL Rnasin核酸酶抑制剂25Units 0.75μL M-MLV Reverse Transcriptase 200U 1μL 无核酸水 2μL Total volume 25μL 轻弹或短暂离心混合溶液。37℃孵育60min进行反转录反应，然后在-20℃保存。 3.2.3.4. 3′和 5′RACE cDNA模板的合成 利用 SMART TM RACE Amplification Kit (Clontech）合成 RACE 模板。 （1）Buffer Mix 5×First-stand Buffer 4μL DTT(100mm） 0.5μL dNTP Mix(20mm） 1.0μL Total volume 5.5μL （2）5′RACE cDNA 去除 DNA 的 RNA 2μL 5′-CDS primer A 1μL Sterile H2O 8μL （3）3′RACE cDNA 去除 DNA 的 RNA 2μL 3′-CDS primer A 1μL Sterile H2O 9μL （4）（2）和（3）两离心管中的混合物分别混匀，短暂离心。 （5）72°C 下加热3min，然后42°C 下保温2min；在冰中冷却2min后 14000g离心10s。 （6）向5′RACE cDNA中加入1μL SMARTerⅡA oligonucleotide，轻微振荡后短暂离心。 （7）室温下混合以下试剂： Buffer Mix 5.5μL RNase inhibitor 0.5μL SMART Scribe Rererse Trancriptate(100U） 2μL Total volume 8μL （8）向上述混合液中分别加入（6）中的 5′RACE cDNA 和（3）中 3′RACE cDNA，终体积为 20μL。 （9）轻微振动离心管瞬时离心，42°C孵化90min，之后于 72°C下保温 10min。 （10）加入90μL Tricine-EDTA Buffer对RACE cDNA库进行稀释，cDNA库在-20°C可保存三个月，或在-80°C长期保存。 3.2.4河蚬CCK, Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 3.2.4.1 3'RACE和5'RACE cDNA 扩增 根据本实验室转录组测序所得的CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因序列片段, 设计3'和5'RACE 特异性引物，引物设计采用 Primer Premier 5.0 软件进行， 所设计的引物由上海生工生物公司合成（表4-1）。 表3-1 基因克隆与荧光定量 PCR 所用引物序列 Primer name Primer sequence (5’→3’） Application CCK-F GAACAAGCAGAATGACGG qPCR CCK-R ACTCTTCGCCCTTTTACC Conopressin-F TCACTACATCGGTGACTATAA Conopressin-R ATGTTCAGAGTTCATATTGGG FFamide-F TACCGCTATCGCAATCTT FFamide-R GAAAAGGTTTAAGACATCA UPM CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCA ACGCAGAGT Universal primer CCK3F1 ATGCGTCCTCTTTTGTCAGC 3’RACE PCR CCK3F2 TCCTGGGATTATGATTACGG Conopressin3F1 GCTACCAACTGATTTCTCTATT Conopressin3F2 GGTCTAAATGGGCAGCCGTGTT FFamide3F1 CCTACGACGACGAAGAAAT FFamide3F2 AGAGCTATCTGGCGCTAGCAGA CCK5R1 AGGACGCATATTAACTTCTG 5’RACE PCR CCK5R2 AACTCGCGGTCATTTGCACT Conopressin5R1 TCCGGTCAGCAAAACAAAGT Conopressin5R2 GTCTTGGTATGCCTAGTATT FFamide5R1 TCACACATTTCTTCGTCGTC FFamide5R2 CTGTTCATGTTGGGGCTCAC CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的3'和5'引物(表 3-1）分别与通用引物UPM配对，利用SeqAmp™ DNA Polymerase进行3'端和5'端扩增。反应体系为： 3'或5' RACE cDNA库 2.5μL 10×UPM 5μL 3'或5' GSP(10μM） 1μL PCR-Grade Water 15.5μL 2×SeqAmp™ Buffer 25μL SeqAmp™ DNA Polymerase 1μL Total volume 50μL 将上述体系轻微振动混匀，瞬时离心，放入 PCR 仪中进行以下反应： 反应程序： 95°C 预变性 3min 95°C 30s 72°C 3min 循环 5 94°C 变性 30s 68°C 退火 30s 72°C 延伸 3min 循环 25 72°C 延伸 10min 4°C 保存 For ever 取 2μL 反应产物，在 1.5% 的琼脂糖凝胶上进行检测，恒定电压为 120V, 电泳时长为 30min。 3.2.4.2 PCR 产物的分离与回收 根据电泳结果，使用Gel Doc XR+凝胶成像仪在紫外环境中给条带曝光，然后将含有目的 DNA 片段的琼脂糖凝胶切下。胶回收纯化过程基本操作如下： （1）将切下的凝胶块放入 1.5mL 离心管中，每100mg凝胶加300-600μL Buffer B2。 （2）于50°C加热5-10min，其间晃动2~3min至离心管中凝胶全部溶解。 （3）将上述溶化的凝胶液全部移入吸附柱，8000g离心30s，将收集管中的液体倒掉，吸附柱重新放回收集管中。 （4）向吸附柱中加入300μL Buffer B2，9,000g 离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 （5）向吸附柱中加入 500μL Wash Solution，9000g离心 30s，倒掉收集 管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。 （6）重复步骤（5）一次。 （7）将空的吸附柱和收集管放入离心机中，9000g 离心 1min，室温下晾晒 5min。 （8）扔掉收集管，将吸附柱放到一个新的离心管中， 15μL Elution Buffer，室温放置 1~2min，9000g离心1min，收集 DNA 溶液， 该溶液可于-20°C 保存。 （9）将离心得到的DNA溶液重新加回吸附柱中，重复步骤（8），以提高DNA的回收量。 （10）琼脂糖凝胶电泳检测回收情况。 3.2.4.3 扩增片断连接并导入大肠杆菌细胞 使用pMD20-T Vector（TaKaRa）试剂盒将回收的DNA片断与T载体相连接， 连接反应体系如下： pMD20-T 1μL 纯化的DNA片断 1μL 无核酸水 3μL Solution Ⅰ 5μL Total volume 10μL 16°C 反应30min。 质粒转化 （1）取 100 μL 感受态细胞（JM109）在冰水中融化。 （2） 取10 μL 已转入目的片段的载体与感受态细胞溶液相混合，将混合物混匀，放置于冰上 30 min。 （3）在42°C水浴锅中热激45 s，立即放置于冰上冷却1min. （4）向离心管中加入890μL SOC无 AMP 液体培养基，吹打混匀，37°C下 于振荡培养箱中200 rpm培养60 min。 （5）室温下，4000rpm离心4min，将部分上清液吸出，剩下200μL 左右，吹打重新使细胞悬浮。 （6）将7 μL 20 mg/mL的IPTG和40 μL 20mg/mL 的X-Gal加入到含有AMP的平板培养基上，涂布均匀，然后加入100 μL的菌液，用涂布环（事先用酒精灯烧，放皿内侧冷却）涂平板。 （7）在37°C 恒温培养箱中正向培养1个小时，之后倒置培养过夜（12-14h）。 筛选阳性克隆 （1）按照1000:1的比例在 LB 液体培养基中加入AMP，混匀，向1.5 mL离心管中加入1 mL含有AMP的LB液体培养基，然后用无菌牙签从培养平板中挑取10个白色单菌往每个离心管中轻蘸几次，放入37°C振荡培养箱中200rpm培养6-8h。 （2）选择M13引物对阳性克隆进行PCR筛选，PCR 反应体系如下： GoTaq® Green Master Mix, 2X 12.5μL 菌液 2μL M13-F（10 μM） 1μL M13-R（10 μM） 1μL 无核酸水 8.5μL Total volume 25μL 用移液枪轻轻吹打，使 PCR 管中样品混匀，用小离心机进行瞬时离心，使样品聚于管底，之后进行 PCR 扩增，反应参数如下： 95°C预变性 5min 95°C变性 30s 58°C退火 30s 72°C延伸 1min 循环数 30 72°C延伸 10min 4°C保存 For ever （3）取5μL PCR反应产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，选择目的条带清晰的菌液进行测序。 3.2.5 序列分析 使用Bioedit软件对测序结果进行载体序列去除和序列拼接，使用Expasy (http://www.expasy.org/)预测开放阅读框(ORF)并翻译成氨基酸。使用DNAMAN7对CCK, Conopressin和FFamide基因的氨基酸序列进行同源性分析，运用PrediSi (http://www.predisi.de/)对信号肽进行了预测。 3.2.6 CCK, Conopressin and FFamide在不同组织中的相对定量分析 根据河蚬β-actin基因和克隆所得的CCK, Conopressin and FFamide基因序列, 设计了定量PCR引物 (附录5)，进行相对基因表达量的检测。按照前述提取河蚬不同组织(包括内脏团、鳃、腹足和外套膜)的RNA并反转录合成cDNA。使用了Promega公司的Master Mix预混液，按照比例配置扩增体系。扩增体系总体积为20μL，其中PCR反应液包括10μL定量PCR Master Mix、0.4μL（200nM）正向引物、0.4μL（200nM）反向引物、2μL（100ng）cDNA模板，加无核酸水至20μL。PCR反应使用7500 Real-Time PCR system，程序为预变性95℃，5min；40个循环：95℃ 15s，55℃ 30s，72℃ 30s；最后一个循环做出熔解曲线：95℃ 30s，57℃ 30 s，72℃ 60s，为了确定产物的唯一性和实验的有效性。每个样品三次重复。内参基因为β-actin[41]，目的基因的相对表达量根据2–ΔΔCt法计算[166]。实验的数据均通过SPSS 16.0进行数据分析。结果均表示为平均值±标准误差（means±SEM），实验组与对照组间差异分析用one-way ANOVA，差异显著性用Levene’s和LSDt-test检验，显著性水平为p<0.05。柱状图使用作图软件Orign 8.0完成。 3.2.7 4种有机磷酸酯暴露下CCK, Conopressin and FFamide基因表达变化 河蚬的暴露采用半静水法，暴露容器为圆柱形玻璃缸，暴露液溶剂为5L，亚慢性暴露时间为30d，暴露期间保持环境条件稳定，并喂食人工培养的绿藻或纱绢过滤的螺旋藻粉，具体暴露条件和规范见附录2。 毒性暴露时，选取体型大小相似、健康无伤的河蚬，平均体长15mm左右，随机放入各实验组，每个实验组30只。暴露组浓度设空白对照，20μg/L，200μg/L，2000μg/L的TDCPP，TBP，TBEP和TCEP，每组三个平行。对处理完毕的不同浓度暴露后内脏团组织样品进行总RNA提取，并反转为cDNA，以β-actin基因作为参照基因，反应体系和程序如 3.1.5，检测不同浓度TDCPP，TBP，TBEP和TCEP对河蚬内脏团CCK, Conopressin and FFamide基因表达量的影响，数据处理及分析同3.2.5。 3.3结果与分析 3.3.1 河蚬CCK, Conopressin and FFamide基因的cDNA克隆与序列分析 将测序获得的cDNA序列进行拼接分别得到河蚬CCK，Conopressin和FFamide基因全长（图3-1）。全长分别为1239 bp, 1352 bp和679 bp，其中5‘-UTR(非编码区)长分别为为413 bp，452 bp和85 bp，开放阅读框(ORF)长分别为522 bp，459 bp和273 bp，3’-UTR(非编码区)长分别为304 bp，441 bp和321 bp, 其中包括一个终止密码子，多聚腺苷酸加尾信号(Polyadenylation Signal Site)(AATAAA)和PolyA尾。 氨基酸序列分析表明，CCK神经肽由17个氨基酸组成，推导的分子量为19.18kDa。河蚬CCK神经肽与其他非脊椎动物多序列比较结果显示CCK氨基酸序列保守性低。例如与珍珠贝同源性为27.37%，与海蜗牛同源性为26.82%，与牡蛎同源性为22.35%。CCK的多重比对揭露了C末端的DYGLGGGRF在所选取的序列中完全保守（图3-2）。Blast和ClustalW分析显示Conopressin与大海鹿和海兔的同源性为42.20%，与牡蛎和珍珠贝的一致性分别为41.62%和38.15%。在这些物种中，N末端的CFIRNCP序列和C末端的GICCD序列是完全保守的。推导的FFamide氨基酸序列通过BLAST and ClustalW分析得出与双壳贝类更加保守，例如珍珠贝（31.73%），牡蛎（29.81%），但在其他软体动物中保守性低一些，如耳鲍（27.88%），玄妙微鳍乌贼（24.04%）。在这五个物种中发现NSLFF为高度保守序列。 图3-1 CCK, Conopressin and FFamide神经肽基因cDNA全长克隆序列和前体氨基酸序列 推导的氨基酸序列在核苷酸序列下方显示，推定的信号肽序列下面画黑色线，预测的神经肽成熟体标为红色并下划线，预测的运载蛋白标为紫色，基本剪切位点标为绿色，半胱氨酸残基蓝色，C末端酰胺化的甘氨酸标为橙色。 图3-2 河蚬CCK, Conopressin and FFamide神经肽基因前体氨基酸序列与其他物种的多重比对。在所有物种都保守的残基全标黑，只有一个不保守的全标灰色。使用的其他序列来源如下： CCK: 珍珠贝P .fucata (Pinctada fucata Genome Ver 1.00, scaffold3913.1|size60815pfu); 牡蛎C. gigas (EST CU986686, EST CU993470); 海蜗牛A.californica (XP_005096263.1). Conopressin: 珍珠贝P .fucata (Pinctada fucata Genome Ver 1.00, pfudmixc42469g19050 IsotigID scaffold414176.1:1..292); 牡蛎C. gigas (EST AM854257.1(A)/FQ666404(C)); 海蜗牛A.californica (ACN24615.1); 静水椎实螺L. stagnalis(AAB35220.1);大海鹿A. kurodai(BAB40371.1). FFamide: 珍珠贝P .fucata (Pinctada fucata Genome Ver 1.00, scaffold38094.1);牡蛎C. gigas (CU987867); 耳鲍H. asinina (EST GD272468.1); 玄妙微鳍乌贼I. paradoxus (EST DB917831.1). 3.3.2 CCK, Conopressin, and FFamide基因组织分布 利用荧光定量PCR分析了河蚬CCK, Conopressin, and FFamide基因在不同组织中的表达水平，结果表明（图3-3），CCK基因在内脏团中表达量最高，接着是外套膜，鳃和腹足。而对于Conopressin，除了在内脏团中表达量最高外，在鳃，腹足和外套膜中表达量都比较低。而FFamide在腹足和外套膜中极少表达除了内脏团和鳃。 图3-3 CCK, Conopressin和FFamide神经肽在河蚬内脏团、鳃、腹足和外套膜中表达量 3.3.3 4种有机磷酸酯暴露后CCK, Conopressin和FFamide基因表达量在内脏团中的变化 使用荧光PCR 检测了20, 200和2000 μg/L浓度的TDCPP，TBP，TBEP和TCEP 30天暴露后河蚬内脏团中CCK, Conopressin和FFamide基因相对表达量的变化（图3-4）。结果表明，200和2000μg/L的TDCPP暴露组使CCK基因表达量与对照组相比上调了2.12和2.09倍，显著性提高，而20μg/L暴露组对CCK表达没明显影响。TBP暴露组随着浓度升高，CCK表达量逐渐提高（200μg/L，2.43倍；2000μg/L，4.37倍），20μg/L处理中无明显变化。TBEP的所有浓度暴露组与对照组相比都显著上调CCK表达水平，分别升高了2.48倍，3.34倍，3.09倍。而TCEP暴露组对CCK表达水平没明显影响。4种有机磷酸酯只有TCEP暴露组显著上调了Conopressin基因相对表达量（20μg/L，2.77倍；200μg/L，2.68倍；和2000 μg/L，3.19倍）。FFamide表达水平都受到了4种有机磷酸酯的显著性诱导（p<0.05，图3-4），其中都是200μg/L处理组上调最高，呈现倒U型。 图3-4 四种有机磷酸酯对CCK神经肽mRNA相对表达量的影响 注：数据均使用 mean±SEM（n=3）表示。使用单因素方差分析进行显著性水平检验，显著性水平为 p < 0.05，* 表示具有显著性差异。 图3-5 四种有机磷酸酯对Conopressin神经肽mRNA相对表达量的影响 注：数据均使用 mean±SEM（n=3）表示。使用单因素方差分析进行显著性水平检验，显著性水平为 p < 0.05，* 表示具有显著性差异。 图3-6四种有机磷酸酯对FFamide神经肽mRNA相对表达量的影响 注：数据均使用 mean±SEM（n=3）表示。使用单因素方差分析进行显著性水平检验，显著性水平为 p < 0.05，* 表示具有显著性差异。 3.4结果讨论 3.4.1河蚬CCK, Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆及序列分析 目前对神经肽基因的研究主要集中于脊椎动物和海洋软体动物，双壳贝类特别是我国淡水双壳贝类神经肽研究仍是一片空白，本研究首次克隆河蚬CCK, Conopressin和FFamide神经肽基因 , 这3个基因全长分别为1239 bp, 1352 bp和679 bp，包括522 bp，459 bp和273 bp开放阅读框，分别编码173，152和90 个氨基酸，分析了这3个神经肽氨基酸序列的特征并用Blast和ClustalW与其他非脊椎软体动物进行了比对，发现CCK, Conopressin和FFamide神经肽的保守性在22.35%到42.20%之间，保守性较低，CCK具有DYGLGGGRF保守氨基酸，Conopressin神经肽N末端的CFIRNCP序列和C末端的GICCD序列是完全保守的，发现NSLFFN是FFamide神经肽的高度保守序列。在脊椎动物中CCK涉及到胰腺液的分泌[167]，在非脊椎动物中CCK 在结构和功能上与胃泌激素有关，都是调控消化和进食[47]，CCK的生物活性肽区域(QGSWDYDYGLGGGRF-NH2 and AKSYGDYSLGGGRF-NH2)与其他非脊椎动物非常保守. 第一个确定的Conopressin神经肽在结构上与vasopressin相关，在杀手芋螺的毒液中发现[71]并且报道称在静水椎实螺中起到调控性行为的作用。在结构上，紧接着信号肽后面的是N末端Conopressin成熟体，序列是CFIRNCPPG-NH2，而毗邻C末端的神经垂体素包含14个半胱氨酸残基后面紧接着一个未剪切的和肽素同源区域。FFamide首先在静水椎实螺[168]，帽贝[169]和比萨茶蜗牛[169]中发现，在结构上与节肢动物SIFamide神经肽类似[170]。突出了典型的软体动物FFamide神经肽前体的结构特征，即包含一个信号肽，通过在二碱基位点剪切出的2个FFamide成熟体序列。据报道，FFamide与果蝇输精管精子运输有关并且调控性行为[171]。在河蚬中，2个推定的FFamide生物活性区域是DEGYSRLVQQKPLLFamide和GVSPNMNSLFFamide。 3.4.2 CCK, Conopressin, and FFamide基因组织分布分析 河蚬CCK, Conopressin, and FFamide基因在各组织中都有所表达，在脊椎动物中，CCK在脑中的表达非常丰富[47, 78]。在比萨茶蜗牛中，Conopressin很清楚的在胰腺，腹足肌肉，，卵精巢和和射囊中鉴定出来[56]。尽管之前的研究发现软体动物神经肽主要在中枢神经系统[47]或神经器官[172]表达，但河蚬非常小很难将神经系统从其他组织分离出来，并且还没有河蚬神经系统的报道。内脏团，鳃，腹足和外套膜经常被用来分析河蚬基因的组织分布[173-175]。从组织表达的结果来看，3个神经肽都在内脏团中表达量最高。内脏团是一个包括许多器官的混合组织，河蚬神经系统可能包含于其中。而其他3个组织是单一并明确的，有限或没有神经系统在这些组织，因此CCK，Conopressin和FFamide神经肽的表达水平与在内脏团中相比很低或几乎没有。 3.4.3 4种有机磷酸酯暴露后CCK, Conopressin和FFamide基因表达变化分析 河蚬因其广泛的地理分布，与底泥直接接触而作为一个很合适的淡水环境检测物种[132, 176]。在目前研究中，我们使用河蚬内脏团中CCK, Conopressin和FFamide神经肽基因表达的变化来评估TDCPP，TBP，TBEP和TCEP慢性暴露的影响。这四种典型的有机磷酸酯广泛的在阻燃剂和塑料工业中使用[88, 89, 177, 178]。目前还没有文献报道环境污染物暴露对脊椎和无脊椎动物CCK，Conopressin和FFamide表达的影响。文献报道了HgCl2比ZnCl2更能影响到gastrin/CCK8的行为和免疫反应[70]。 在我们的结果中200μg/L和2000μg/L TDCPP暴露下，CCK基因相对表达量显著上调，并且上调倍数一直，说明CCK表达对这两个浓度的TDCPP暴露敏感，而20μg/L TDCPP暴露组对CCK表达无明显效应，说明CCK表达对该浓度TDCPP不敏感。TBP对CCK表达呈现出剂量-效应关系，浓度越高，诱导效应越强，CCK表达可以很好的反应不同浓度TBP暴露的影响，表明CCK是TBP潜在的生物标志物，TBP被认为具有神经毒性[179]，而CCK是神经元细胞分泌的信号传递物质，可能TBP对河蚬神经系统有损伤并诱导了CCK的大量分泌。同样TBEP从低浓度到高浓度对CCK表达都有明显诱导效果，但文献关于TBEP的毒性报道十分有限，CCK对TBEP的敏感性比其他几个有机磷酸酯都要高，其具体影响机制还需要更深入的研究。不同浓度TCEP暴露对CCK表达水平没有明显影响，文献报道[108, 180]长时间的TCEP暴露后，大鼠大脑出现萎缩退化并有癌变效应，在这里CCK可能不是TCEP的作用靶点，CCK对TCEP也不敏感。 不同浓度的TDCPP，TBP和TBEP暴露对Conopressin表达没有明显效应，但TCEP的所有浓度都能引起Conopressin的显著性上调，结果表明Conopressin能很灵敏的指示TCEP的暴露影响，是TCEP的潜在生物标志物。 而FFamide神经肽基因相对表达量对不同浓度的4种OPFRs都呈现出倒U型，都是显著性上调，在20μg/L和200μg/L浓度下，随着浓度升高，FFamide相对于对照组表达量也越高，但在2000μg/L浓度下效应下降，可能是FFamide神经肽表达很容易受到有机磷酸酯的影响，在高浓度超过了分泌FFamide神经元细胞的能力，反而不如200μg/L处理组诱导效应高。之前有文献报道河蚬经常在3.13 mg/L 毒死蜱暴露下关闭双壳[9]. 河蚬闭壳的现象也曾在水中金属暴露下有过报道[181]。高浓度OPFRs暴露下河蚬可能通过闭壳来保护自身。四种OPFRs都对FFamide产生类似效应更加印证了，FFamide能很好的标志OPFRs的影响。 3.5 本章小结 本章通过RACE技术克隆了CCK, Conopressin和FFamide神经肽基因的全长序列，运用生物信息学软件分析了这些全长序列，使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布，并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响，筛查了神经肽标志物。主要结论如下： 1、CCK, Conopressin和FFamide神经肽具有典型的软体动物神经肽特征，在不同组织的表达情况反映了神经细胞的分布。 2、TDCPP、TBP和TBEP对CCK神经肽基因都有不同程度上调影响，CCK基因可作为这3种有机磷酸酯的潜在标志物。仅有TCEP对Conopressin有显著诱导作用，而对CCK没有明显效应，可作为区别TCEP与其他污染物的标志物。4种OPFRs对FFamide都有显著效应，呈倒U型，表明FFamide能很灵敏的应答这4种标志物，高浓度的暴露效应下降，可能是降低了河蚬的健康水平，使其机能下降。 第四章 有机磷酸酯TDCPP和TBP对河蚬毒性效应与作用机制研究 4.1 引言 目前，有机磷酸酯阻燃剂在生活生产中大量使用，而其对人和动物的毒理学效应还不是很清楚，本研究使用RNA-seq技术探究了TDCPP和TBP暴露后，河蚬转录组数据的变化，并对河蚬行为学指标，基因表达变化和酶活性进行了验证。 4.2 材料与方法 4.2.1 实验材料 磷酸三（1,3-二氯异丙基）酯（TDCPP，CAS:13674-87-8；纯度﹥98%）； 中性红溶液（浓度为1 mg/L）； 磷酸三丁酯（TBP，CAS:126-73-8；纯度﹥98%）； 其中，由于有机磷酸酯不溶于水，将2种有机磷酸酯溶于丙酮并储存于棕色试剂瓶中，置于4℃冰箱中备用；中性红现配现用。 4.2.2 毒性暴露实验 暴露实验详见附录4。毒性暴露时，选取体型大小相近、健康无伤的河蚬，平均体长20.47±2.15mm左右，随机放入各实验组，每个实验组30只。暴露组浓度设空白对照，20μg/L，200μg/L，2000μg/L，每组三个平行。暴露阶段结束后采集河蚬的内脏团组织并提取蛋白和RNA于-80℃保存。 4.2.3 河蚬行为学指标测试 参照国内外文献中贝类行为学研究的方法，建立了能够应用到水生态毒理学中的河蚬行为学指标——虹吸作用的测试方法。 方法如下：河蚬生活在水底，靠进水管和出水管过滤水中的食物为生，国外很早就有研究，利用河蚬的虹吸作用指标来监测水体中的环境污染物。本方法主要基于Cooper和 Bidwell（1996）的方法，在其方法的基础上进一步改进。暴露实验结束后，分别取空白组和暴露组各个组河蚬5只，立即放入盛有100mL中性红溶液（浓度为1mg/L）的烧杯中，使用分光光度计测定此时在530nm处的吸光值；2h以后再测定吸光值，根据以下公式计算河蚬的虹吸效率m（mL/animal/h）。 公式： ，（4-1） 注：M为测试溶液的体积，n是河蚬的数目，t为测试时间，c0 为开始测试时溶液的吸光值，ct为测试结束时溶液的吸光值。 4.2.4 河蚬生化指标测试 河蚬的生化测试指标包括河蚬内脏团组织中Caspase-3，Caspase-8和Caspase-9的酶活性。在测定之前，需要提取河蚬各个组织的蛋白，具体操作流程和步骤如下： 4.2.4.1蛋白提取 河蚬蛋白提取的方法，具体步骤如下： （1）取50-100mg内脏团组织于1.5mL EP管中，加入200μL裂解液I（30 mM Tris，2M硫脲，1% w/v DTT，7M尿素， 4% w/v CHAPS，蛋白酶抑制剂），置于冰上，用电动研磨器研磨充分。 （2）在研磨后的溶液中补充加入400μL裂解液I，混匀后置于冰上，间隔超声，功率80-100W，超声5s，冷却10s，共进行10个循环。 （3）4℃，12000×g离心10 min，取上清，避开上层油脂。 （4）每份样品取3μL用于蛋白定量，定量步骤按2-D Quantity kit（GE Health）试剂盒说明进行。 （5）根据测得的蛋白浓度，将每份样品用裂解液稀释到3mg/mL。放于-80℃中备用。 4.2.4.2 Caspase-3，Caspase-8和Caspase-9酶活性测定 本实验测定了河蚬内脏团Caspase-3，Caspase-8和Caspase-9的酶活性，均采用购自碧云天生物技术研究所（中国江苏）的相应试剂盒按照说明步骤进行测定，具体方法如下： Caspase 3酶活性的检测： 1. 准备工作： a. 裂解液溶解后混匀并置于冰浴上备用。 b. 检测缓冲液溶解后混匀并置于冰浴上备用。 2. 测定pNA标准曲线： a. 标准品稀释液的配制：按照每0.9ml检测缓冲液加入0.1ml裂解液的比例配制适量的标准品稀释液。 b. 将试剂盒中的pNA (10mM)用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100和200μM，作为标准品。 c. 每个浓度取100μl用酶标仪进行检测，测定A405。 d. 用每一个标准品的A405减去空白对照的A405计算出吸光度，并制作出pNA浓度相对于A405的标准曲线。 3. Caspase 3酶活性的检测： 将试剂盒中的Ac-DEVD-pNA (2mM)，置于冰上融化。 如下设置反应体系： 空白对照 样品 检测缓冲液 40μL 40μL 待测样品 0μL 50μL 裂解液 50μL 0μL Ac-DEVD-pNA (2mM) 10μL 10μL 总体积 100μL 100μL c. 加完试剂后，将混合液在37ºC保温60分钟。测定样品的A405。 d. 将样品的A405减去空白对照的A405，即为样品中Caspase 3催化产生的pNA产生的吸光度。通过标准曲线的计算就可以产生了多少量的pNA。 Caspase 8酶活性的检测： 试剂采用Caspase 8试剂盒，其他反应体系和步骤同Caspase 3 Caspase 9酶活性的检测： 试剂采用Caspase 9试剂盒，其他反应体系和步骤同Caspase 3 4.2.5 文库构建与测序 4.2.5.1 总RNA提取与质量鉴定 暴露实验结束后，分别提取空白对照组和2000μg/L TDCPP和2000μg/L TBP暴露组河蚬内脏团组织总RNA，为了获取尽可能多的转录本信息，我们采用混合样的方法，取样之前，停止喂食一个星期，取壳长20.47±2.36mm的成年河蚬5只，分别提取内脏团、鳃、腹足和外套膜等组织，进行总RNA提取，对总RNA纯化和鉴定后等比例混合。提取采用Trizol法。使用QUBIT2.0光度仪和安捷伦Agilent 2100 Bioanalyzer 进行RNA浓度和质量测定，将RIN≧8且260/280nm光度比值≧1.8的RNA进行下一步建库和上机测序。 4.2.5.2 建库与测序 (1) mRNA纯化与片段化。取4μg总RNA建库，用带有 Oligod(T)的 Beads 对 Total RNA 中 mRNA 进行纯化，然后选择合适程序对mRNA进行片段化； (2) cDNA合成与末端修复。使用Second Strand Synthesis Enzyme Mix和合适程序进行cDNA合成，并在3’端加A； (3) PCR扩增与产物富集。使用合适程序进行PCR使文库产物富集，将产物电泳后切胶纯化。 (4) 文库质控。使用 2100 Bioanalyzer High Sensitivity DNA chip 判断 PCR切胶产物片段大小是否符合后续测序的要求； (5) 混合文库。根据文库的定量及定性结果将每个 library 的摩尔浓度统一调整到 2nM，然后根据实验设计选择性的将需要混合的 library 进行等量等浓度混合，保证混合后的 library 的终浓度也是 2nM，体积大于等于 10 µL ，然后将文库进行-80℃保存。 (6) 上机测序。使用Illumina平台进行双向测序，得到测序数据。 4.2.6 转录本生物信息学分析 对测序得到的原始 reads（双端序列）进行过滤后，将高质量的 reads进行转录本的组装，对转录本进行结构注释和功能注释。把 clean reads 回帖到参考序列上，再基于回帖结果进行表达量分析、差异表达基因功能注释等高级分析。 4.2.6.1测序数据过滤及统计 对原始数据进行过滤，使用 ngsQCToolkit-2.3.3 2 软件过滤掉低质量 reads 和有引物污染的 reads。 4.2.6.2 转录本组装 使用 Trinity 3 对 clean reads 进行组装，Trinity 利用 de Bruijn graph path 算法对 reads进行 denovo 拼接。得到组装后的 Unigene Library（Trinity.fasta），过滤掉外显子总长低于 200bp 的转录本后，得到一个最终的转录本序列文件。 4.2.6.3功能注释 使用 blast 软件将转录本序列与各主流数据库(Nt，Nr，GO，KEGG，Swiss-Port)进行比对；利用 HMMER 7 进行蛋白质结构域预测；signalP 8 进行信号蛋白预测；tmHMM 进行跨膜区域预测，最后利用Trinotate 整合注释结果。 4.2.6.4表达量分析 在 RNA-seq 分析中，我们可以通过定位到基因组区域或基因外显子区的测序片段（Fragment，一条 fragment 指一对 reads 所在的序列片段）计数来估计基因的表达水平。Fragment 计数除了与基因的真实表达水平成正比外，还与基因的长度、测序深度成正相关。为了使不同基因、不同实验间估计的基因表达水平具有可比性，引入 FPKM 9 的概念，FPKM （Fragments Per Kilo bases per Million fragmentss）是每百万测序片段中来自某一基因每千碱基长度的片段数目。FPKM 同时考虑了测序深度和基因长度对 reads 计数的影响，是目前最为常用的基因表达水平估算方法。 ???? = (Total exon fragments)/(mapped reads(Millions)×exonlength(KB) )(公式4-2) 我们使用 RSEM 软件进行表达量分析。 4.2.6.5 差异表达基因分析 使用 edgeR 10 找出不同样本间存在差异表达的转录本。挑选|log 2 FC|>=1 并且p value<=0.001 2="" log="" fc="">=1 即为TDCPP和TBP暴露组上调基因，log 2 FC<=-1 为TDCPP和TBP暴露组下调基因。 4.2.6.6差异表达基因GO注释和KEGG富集 根据实验目的筛选差异基因后，我们对差异转录本进行了GO 注释和KEGG富集分析，研究差异转录本形成的KEGG信号通路 4.2.7 基因定量验证 使用河蚬β-actin基因作为内参基因，本实验首先对河蚬凋亡系统相关基因进行了基因定量验证，定量PCR引物见附录5。 4.2.8数据处理与分析 结果均表示为平均值±标准误差（means±SEM），实验组与对照组间差异分析用one-way ANOVA，差异显著性用Levene’s和LSDt-test检验，显著性水平为p<0.05。柱状图使用作图软件Orign 8.0完成。 4.3结果与分析 4.3.1 虹吸行为指标测试 30d的暴露实验期间，河蚬死亡率小于3%，且各实验组间死亡率没显著差异。对河蚬的虹吸行为测试结果表明（图4-3，4-4）：随着TDCPP和TBP暴露浓度的升高，河蚬虹吸速率逐渐下降。 图4-3 TDCPP对河蚬虹吸效率的影响 注：河蚬虹吸效率（Filtration rate）的单位为mL/animal/h，即每只河蚬每小时的过滤水的体积。数据均使用 mean±SEM（n=5）表示。 图4-4 TBP对河蚬虹吸效率的影响 注：河蚬虹吸效率（Filtration rate）的单位为mL/animal/h，即每只河蚬每小时的过滤水的体积。数据均使用 mean±SEM（n=5）表示。 4.3.2 凋亡相关酶活力测试 根据转录组测序结果，为了进一步探究TDCPP和TBP对河蚬主要毒理机制，暴露实验结束后，提取了河蚬内脏团蛋白样进行Caspase 3，Caspase 8和Caspase 9的酶活性测试。结果见图4-5。其中TDCPP对Caspase 3和Caspase 8活性都有显著性诱导，而只有200μg/L和2000μg/L TBP对Caspase 3和Caspase 8活性有显著诱导。另外TDCPP和TBP对Caspase 9的有上调趋势，但不明显。 图4-5 TDCPP和TBP对Caspase 3,Caspase 8,Caspase 9活性的影响 注：数据均使用 mean±SEM（n=3）表示。使用单因素方差分析进行显著性水平检验，显著性水平为 p < 0.05，* 表示具有显著性差异。 4.3.3 转录组差异表达分析 4.3.3.1 Illumina测序与序列组装 提取空白组，TDCPP和TBP暴露组河蚬内脏团组织进行建库、测序，去除低质量的reads，所有样品过滤前后数据量及质量值统计情况如下表4-2所示： 表4-2 样品过滤前后数据量及质量值统计 Sample Raw Reads Number Raw Bases Clean Reads Number Clean Bases Clean Rate(%) Q20(%) Q30(%) CK 61193398 7710368148 58779228 7406182728 96.06 97.38 94.46 TDCPP 49179514 6196618764 47531434 5988960684 96.65 97.97 95.58 TBP 48210200 6074485200 46529664 5862737664 96.52 97.81 95.27 使用 Trinity 3 对 clean reads 进行De novo组装，对 Trinity.fasta 进行统计分析得到如下内容： 图4-6 河蚬转录本序列长度分布与所占百分比 4.3.3.2 转录本的比对与注释 本实验使用 blast 软件将转录本序列与各主流数据库(Nt，Nr，GO，KEGG，Swiss-Port)进行比对，利用 HMMER 7 进行蛋白质结构域预测；signalP 8 进行信号蛋白预测；tmHMM 进行跨膜区域预测，最后利用Trinotate 整合注释结果。具体结果见图4-3。 表4-3 注释整合结果 数据库 转录本数 注释率% 总转录本 160698 100 Nt 18271 11.4% Nr 17476 10.9% KEGG 8942 5.6% Swiss-Port 23940 14.9% GO 3722 2.3% Pfam 9999 6.2% signalP 9999 6.2% TMhmm 6802 4.2% 4.3.3.3 转录本的鉴定与富集分析 首先使用FRKM方法对转录组的表达水平进行标准化，然后对TDCPP，TBP暴露组与空白对照组鉴定出差异转录本（Differentially expressed transcripts，DETs）。结果显示TDCPP暴露后表达水平有差异的转录本DETs合计8160个（p<0.001，图），其中4037个DETs显著性上调（与对照组相比，表达水平倍数大于等于2），4123个DETs显著性下调（与对照组相比，表达水平倍数大于等于2），而TBP暴露后表达水平有差异的转录本合计8207个（p<0.001，图），其中4162个DETS显著上调与对照组相比，表达水平倍数大于等于2），4045个DETs显著下调与对照组相比，表达水平倍数大于等于2），根据KEGG数据库注释结果，富集出了TDCPP和TBP分别对河蚬的主要作用通路，这里选取前十名的通路列表。 347个DETs注释到了KEGG信号通路，其中TDCPP对河蚬的主要作用通路包括凋亡通路、黏着斑通路、小细胞肺癌通路、细胞黏附分子通路等相关通路。而共有369个DETs注释到了KEGG信号通路，其中TBP对河蚬的主要作用通路包括凋亡通路、小细胞肺癌通路、细胞黏附分子通路等相关通路。 表4-4 TDCPP暴露后DETs的KEGG富集 通路编号 通路名称 DETs ko04210 Apoptosis 49 ko04510 Focal adhesion 56 ko05222 Small cell lung cancer 40 ko05145 Toxoplasmosis 45 ko04514 Cell adhesion molecules (CAMs) 24 ko04064 NF-kappa B signaling pathway 33 ko04640 Hematopoietic cell lineage 15 ko05164 Influenza A 33 ko05134 Legionellosis 24 ko04668 TNF signaling pathway 28 表4-5 TBP暴露后DETs的KEGG富集 通路编号 通路名称 DETs ko04210 Apoptosis 58 ko04970 Salivary secretion 46 ko04514 Cell adhesion molecules (CAMs) 32 ko05145 Toxoplasmosis 53 ko04640 Hematopoietic cell lineage 21 ko04064 NF-kappa B signaling pathway 40 ko05222 Small cell lung cancer 44 ko04662 B cell receptor signaling pathway 21 ko04911 Insulin secretion 20 ko05164 Influenza A 34 4.3.3.4 TDCPP和TBP暴露对河蚬凋亡通路作用机制分析 结合KEGG通路情况，分析了TDCPP和TBP暴露对河蚬凋亡通路的影响。TDCPP和TBP都对河蚬凋亡通路产生了影响。TDCPP和TBP作为凋亡刺激源，激活河蚬凋亡通路，分为两种途径（图4-7），1）线粒体途径，诱导线粒体中细胞色素C上调释放，自由的细胞色素C使Apaf-1与Caspase 9结合体瓦解，Caspase 9自由体将ProCaspase 3转换成Caspase 3成熟体，导致了细胞的凋亡；2）TDCPP和TBP结合到细胞膜的死亡配体结合位点，进而使Caspase 8从结合体上释放，将ProCaspase 3转换成Caspase 3成熟体，导致了细胞的凋亡。 图4-7 凋亡通路示意图 4.3.4 凋亡相关基因的验证 暴露实验结束后，使用荧光定量PCR检测了河蚬内脏团中凋亡相关基因（Caspase 3,Caspase 8,Caspase 9以及Cytochrome C）的表达变化，结果表明（图4-8,4-9），随着你的的升高，TDCPP对Caspase 3,Caspase 8,Caspase 9以及Cytochrome C基因都有上调趋势，其中200μg/L和2000μg/L的TDCPP暴露组显著上调；而TBP随着浓度升高对Caspase 3,Caspase 8,Caspase 9以及Cytochrome C基因表达诱导也逐渐增强，但除了2000μg/L的TBP暴露组对Caspase 9表达有显著之外，其他浓度的TBP暴露组对Caspase 3,Caspase 8,Caspase 9以及Cytochrome C基因上调影响都不超过2倍。 图4-8 不同浓度TDCPP对Caspase 3,Caspase 8,Caspase 9以及Cytochrome C基因相对表达量的影响 图4-9不同浓度TBP对Caspase 3,Caspase 8,Caspase 9以及Cytochrome C基因相对表达量的影响 4.4 讨论 4.4.1 TDCPP和TBP对河蚬的毒性效应 河蚬是淡水底栖生物，直接接触底泥，靠滤食水中有机碎片进食，活动行为少，能直接反映生活水体的长期污染情况，是生物监测的优势物种[132]。目前双壳贝类等虹吸速率已经被用作是水污染持续性监测的一个行为学指标[182]，在30天不同浓度TDCPP和TBP暴露暴露后，河蚬虹吸速率随着暴露浓度升高而逐渐下降。Moulton[183]等报道了96 h氨基甲酸酯类农药暴露后，贻贝和河蚬胆酰酯酶活性受到抑制，虹吸速率下降，生命状态下降，虹吸行为是一个指示生命活性的有效指标。另外，研究证实了多种污染物都可以导致双壳贝类等虹吸速率下降[130, 184]。Liao[181]等研究了段时间内水中不同浓度Cu和Cd对河蚬双壳的张闭速率的剂量效应关系，并成功的建立了河蚬生物评估模型。Cooper[9]等报道了3.13mg/L的毒死蜱暴露后，河蚬的双壳一直都关闭，虹吸速率受到显著抑制，更高浓度下，河蚬已经没有虹吸速率的数据。总之，河蚬速率能有效的反应河蚬的生命状态，不同浓度TDCPP和TBP暴露下，河蚬活力下降，表明了污染物对河蚬造成了影响。 4.4.2 TDCPP和TBP对河蚬的作用机制研究 为了深入探究TDCPP和TBP对河蚬的毒理作用机制，我们使用2000μg/L TDCPP和TBP对河蚬进行了30天的暴露，然后提取了这两个暴露组和对照组河蚬的内脏团进行RNA-Seq测序。目前，包括河蚬在内的多种生物已经成功运用RNA-Seq技术进行了毒理学机制研究[41, 185-187]，是一种精确，可靠，实用的毒理学研究方法[188]。在本实验中，我们分析了一个对照组加两个暴露组的转录本数据，鉴定出大量差异转录本，并依据主要影响通路，验证了生化指标和基因表达结果，更加印证了转录组得出的毒理机制结果。 对KEGG结果分析后，我们发现TDCPP暴露主要激活了河蚬凋亡通路、黏着斑通路、小细胞肺癌通路、细胞黏附分子通路等相关通路。而TBP对河蚬的主要作用通路包括凋亡通路、小细胞肺癌通路、细胞黏附分子通路等相关通路。凋亡通路是TDCPP和TBP对河蚬的主要影响通路，Na Ta[189]等报道了TDCPP暴露引起了PC12细胞的凋亡数量上升。Chen[190]等研究发现TDCPP能引起斑马鱼胚胎的凋亡现象。目前，国内外对TBP的毒理学研究很少，所以我们重点围绕凋亡通路进行了研究。细胞凋亡一般有两种途径：线粒体途径和外源途径。我们分析了KEGG中差异转录本后发现Caspase 3, Caspase 8, Caspase 9以及Cytochrome C基因上调达到2倍。刘晓婷[191]等介绍了线粒体凋亡途径中细胞色素C释放结合凋亡蛋白酶活化因子-1（apoptosis protease activating factor 1，Apaf-1）激活Caspase 9，进而激活Caspase 3导致细胞的凋亡。Abhari1[192]等报道了相关死亡结构域蛋白（Fas-aasociated death domain ，FADD）凋亡途径途径，外源凋亡因子通过FADD与Fas胞浆区呈特异性结合，将信号传导到细胞内，使Caspase 8激活，并进一步激活Caspase 3，从而引起细胞的凋亡。通常，正常细胞中的 Caspase 均以无活性，并以酶原形式（pro-Caspase)存在，而外源凋亡诱导信号刺激细胞后，天冬氨酸残基位点的蛋白水解而激活，引起 Caspase 级联反应，导致细胞凋亡发生。我们使用凋亡试剂盒测定了Caspase 3,Caspase 8,Caspase 9的酶活性，发现所有TDCPP暴露组对Caspase 3和Caspase 8活性有显著性诱导作用，在高浓度与相关基因的验证结果一直，而对Caspase 9酶活只有升高趋势，没有达到显著性诱导，Caspase 9是线粒体途径关键酶，说明TDCPP介导的凋亡以外源凋亡途径为主。同样只有200μg/L和2000μg/L 的TBP暴露组对Caspase 3和Caspase 8酶活产生了显著性上调，对caspae 9作用不明显，相对应当基因验证结果只有上调趋势，除了2000μg/L暴露组对Caspase 9诱导效应明显，其他组对包括细胞色素c在内的凋亡相关基因都没有起到显著性影响。相反200μg/L和2000μg/L 的TDCPP暴露组对Caspase 9和细胞色素c都产生了现在性诱导，结合酶活结果，说明TDCPP对河蚬的凋亡效应比TBP要强。总之，实验结果验证了RNA-Seq差异转录本分析出的凋亡通路结果。 4.5 本章小结 本章通过对TDCPP和TBP暴露后河蚬虹吸行为测试与RNA-Seq表达谱研究，研究了TDCPP和TBP对河蚬的毒理学机制。得出以下结论： 1、低浓度和高浓度的TDCPP和TBP均能引起河蚬虹吸率的下降，对河蚬造成健康状况的影响； 2、RNA-Seq分析结果表明，TDCPP和TBP暴露产生了大量差异转录本，成功运用到毒理学机制研究中。 3、TDCPP暴露主要激活了河蚬凋亡通路、黏着斑通路、小细胞肺癌通路、细胞黏附分子通路等相关通路。而TBP暴露对河蚬的主要作用通路包括凋亡通路、小细胞肺癌通路、细胞黏附分子通路等相关通路。 4、通过河蚬生化指标和基因指标验证，TDCPP和TBP暴露对造成了河蚬内脏团细胞的凋亡效应，主要通过外源凋亡途径，TDCPP比TBP对河蚬细胞的凋亡作用要强。 第五章 总结与展望 本研究以我国淡水双壳物种河蚬为实验生物，通过Selox测序获取并鉴定了河蚬保守和新miRNAs，预测了miRNA与4个环境相关基因的关系，为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。填补了河蚬miRNA生物信息的不足。运用RNA-Seq表达谱技术分析了TDCPP和TBP暴露后河蚬的差异转录本，重点分析凋亡通路，并验证了生化和基因指标，与RNA-Seq结论一致，并且主要是通过外源凋亡途径，还分析得出TDCPP比TBP对河蚬的凋亡效应强。成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽cDNA全长基因，并对它们的氨基酸序列进行了同源性比对和分析，开发并初步应用了河蚬神经肽标志物，评估了四种有机磷酸酯的毒性效应，对应用这些标志物完成了实验论证。 目前，我国水体污染的生态毒理学研究还处在发展阶段，大量的化学品与相关标志物的筛查还需要进一步研究，以河蚬为受试生物并结合RNA-Seq开发生物标志物的方法能很好的评估化学品的毒性效应与机制，但是还需要完善几个方面： 1、河蚬生物信息学比较缺乏，亟待开发出完整的生物信息学背景； 2、神经肽标志物的开发还处于起步阶段，完善的标志物评估体系需要进一步建立起来； 3、目前的研究仅以成年河蚬为受试对象，以后需要建立针对河蚬受精卵、幼蚬的毒性测试方法。