实验专栏丨纯化外泌体:轻松高效非我莫属!

首先，当务之急是高效纯化外泌体。如今的方法这么多，不知如何选择？那么，我们就来读读最新的文献，听听其他研究人员的心得体会吧。近日，澳大利亚的研究人员在《Journal of Extracellular Vesicles》期刊上发表文章，展现了来源于人肾近端小管上皮细胞（PTEC）的外泌体的分子图谱（1）。

在各种肾脏疾病中，人肾近端小管上皮细胞（PTEC）调控了疾病的进程。比如，在以炎症为特征的急性损伤期，PTEC可能发挥调节作用，而在以缺氧为特征的慢性纤维化疾病状态，PTEC可能发挥致病作用。一些研究也表明，来源于PTEC的外泌体可能在疾病发展中发挥作用。不过，目前还没有研究直接鉴定正常或疾病状态下人原代PTEC中的外泌体。

为了解决这个问题，研究人员在正常条件以及代表急性或慢性疾病的炎性和缺氧条件下培养了人原代PTEC，并鉴定和纯化了外泌体。他们的结果表明，利用一种商业化的试剂盒可轻松地从人原代PTEC中纯化外泌体，并且外泌体的数量在炎性和缺氧状态下升高。这些外泌体包含了与肾脏疾病相关的miRNA和蛋白质，有望作为治疗靶点。

在这项研究中，他们比较了两种外泌体纯化方法：传统的超速离心/密度梯度（UC/DG）和商业化的试剂盒，来自QIAGEN的exoEasy Maxi Kit。他们之所以花时间来开展这种比较，是因为对之前使用的UC/DG方法不甚满意。他们表示，UC/DG方法不仅费时费力，而且容易出现技术问题，包括离心管破裂和密度梯度解离，造成外泌体样本损失。

相比之下，采用exoEasy Maxi Kit，不仅简单高效，而且重复性更好。他们的研究结果清晰表明，通过此试剂盒纯化的外泌体在质量上与UC/DG方法相当，但产量要高得多，这也许是因为样本所经历的离心步骤大大减少。

从图中可以看出，利用超速离心/密度梯度纯化（UC-DG）和QIAGEN的exoEasy Maxi Kit获得的外泌体表现出相当的纯度。这两种方法纯化所得的PTEC外泌体都表达CD9，但不表达钙联蛋白（a）。从相同量的细胞培养物中纯化外泌体，试剂盒在产量上略胜一筹（b）。通过qNano纳米颗粒分析系统的分析，这两种方法产生的外泌体在大小分布上表现相当（c）。

整个流程仅仅需要25分钟。将预先过滤过的血浆、血清或细胞培养上清与缓冲液XBP进行混合并结合在exoEasy膜亲和离心柱上。之后利用缓冲液XWP对外泌体进行洗涤，并使用缓冲液 XE（主要含无机盐的水缓冲液）进行洗脱，即可用于物理或生化分析。不过，对于生物检测等特定应用，可能需要进行额外的浓缩或缓冲液的置换。这个可通过孔径尺寸为100 kDa或更小的超滤方法来实现。

有了高纯度的外泌体在手，现在你可以分析其物理性质，也可以在电镜下细细观察。对它携带的货物感兴趣的同学，也可以提取出其中的DNA、RNA、蛋白质或脂类，来开展进一步的分析。你瞧，没有超速离心机，我们一样能玩转外泌体研究。

若你想分析外泌体中的RNA，可以像文献中那样，继续使用QIAGEN的RNeasy Kit。当然，还有一种更省时省力的方法，那就是使用exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit。这个试剂盒的前半部分与exoEasy一样，之后则利用QIAGEN miRNeasy技术来分离总RNA(包含miRNA)。从血清/血浆样本到RNA(miRNA)产物，整个实验流程也只不过1小时，是不是大大超出你的预期呢。

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▐ 文章来源：生物通

▐作者：徐亮

▐ 原文链接：http://www.ebiotrade.com/newsf/2017-7/2017711163654677.htm

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