玉米肽的制备及其生物活性研究进展

作者： 田京歌; 陈海霞; 陈书涵                

作者单位:  天津大学药物科学与技术学院

天津市现代药物传递及功能高效化重点实验室;

文献来源:  食品安全质量检测学报

关 键 词:  玉米肽;制备;分析;活性;应用

发表时间: 2013-06-25

我国玉米的产量占世界总产量的20% 左右, 是世界第二大玉米生产国。国内玉米的消费可分为食用、饲料、工业等, 其中饲料用玉米所占比例最大, 约占我国玉米总需求量的70% 以上; 但随着玉米深加工业的发展和乙醇燃烧技术的应用, 玉米在工业中的消费逐年增高[1]。玉米生产加工的主要副产物是玉米蛋白粉(corngluten meal), 其蛋白质含量67%~71%, 其余成分为12%~15％的淀粉、3%~7%的脂肪、1%~2%的纤维素和1%~2%的灰分等。玉米蛋白中的主要成分是玉米醇溶蛋白(68%)、谷蛋白(28%)和球蛋白(1.2%)[2, 3]。由于玉米蛋白粉中缺少赖氨酸、色氨酸等人体必需的氨基酸, 且具有特殊的味道和色泽、水溶性差, 玉米蛋白粉主要用于粗饲料生产或者直接被排放处理,造成了资源的极大浪费[4]。

生物活性肽有多种制备方法, 主要包括酶解法、微生物发酵法和化学合成法等[12]。玉米肽作为生物活性肽的一种, 目前较为普遍的制备方法是酶解法及微生物发酵法。

酶解法又包括单一酶和复合酶法。单一酶法指的是单一使用一种酶来制备玉米肽。一般采用的酶可以大致分为3 种: 碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶。不同酶具有不同的催化反应最佳条件, 并且由于其他因素的不同和影响, 它们所得的产率也有差异。复合酶是通过单酶复配后得到的, 其中应考虑各种酶之间的相互作用及搭配比例, 优化出最佳配比方式。复合酶解法是采用不同种类的酶, 在它们的共同作用下来制取所需产品。相对于单一酶解法制备, 采用复合酶解法更方便、快捷、效率高, 且酶活力比较好, 所得产率也较高[13]。

国外采用酶法制备玉米肽的研究较早, Adler–Nissen[14]用碱性微生物酶水解玉米蛋白粉, 并对温度、pH 值和酶浓度对水解的影响进行了研究。Hardwick 等[15]同样用碱性蛋白酶水解玉米蛋白粉,并对酶浓度、蛋白粉的粒度对水解的影响进行了研究。日本在玉米肽方面的研究处于领先地位, 日本学者Miyoshi 和Shinya 等[16,17]报道了玉米醇溶蛋白经酶解得到了Leu–Pro–Pro, 这是迄今发现的蛋白水解得到的最好的血管紧张素转换酶抑制 (ACEI) 肽,效果与临床常用药物卡托普利相当。Yamaguchi 等[5]用来自芽孢杆菌A–7 的一种碱性蛋白酶水解玉米蛋白粉, 水解产物经离子交换树脂和吸附树脂进一步纯化后得到相应的玉米肽, 并对玉米肽的组成和分子量分布进行了研究。

国内对于酶法制备玉米肽的研究相对较晚。翟瑞文等[18]分别采用2709 地衣形芽孢杆菌碱性蛋白酶水解玉米蛋白粉, 并分别对酶解的最佳pH、温度、固液比、时间和加酶量进行了研究。徐力[19]通过一种碱性蛋白酶水解玉米醇溶蛋白, 制备得到具备抗氧化性的玉米肽。隋玉杰等[20]以玉米蛋白粉的浓缩物为底物, 比较了中性蛋白酶和碱性蛋白酶的酶解条件及玉米粗肽的醒酒效果。吴泽柱等[21]采用枯草芽孢杆菌k–1 水解玉米蛋白粉, 确定了最佳的培养基组成, 使得玉米蛋白粉的水解度显著提高。张智等[22]通过单因素试验和响应面综合试验, 确定了枯草芽孢杆菌ls–45 发酵生产玉米多肽的最佳发酵条件, 并对制得的玉米肽进行了初步的分离纯化。黄文浩等[23]采用酶解与膜分离耦合技术连续化制备高活性ACE抑制玉米肽, 该方法得到的玉米肽质量高且稳定。张艳荣等[24]采用微波协同辅助复合酶法制备高F 值的玉米肽, 得到了最优的提取条件。

以上所述的酶水解大多采用的是游离酶, 而固定化酶技术的应用与推广, 使得人们利用固定化酶来水解玉米蛋白粉或者醇溶蛋白成为可能。吴晖等[25]在非水相体系中, 利用固定化碱性蛋白酶水解玉米蛋白粉制备得玉米肽,并对其体外醒酒活性进行了研究。

微生物发酵是酶的最重要来源之一, 许多产品的生产, 如酱油、豆鼓等都会应用到发酵技术, 微生物发酵在大豆肽及油菜籽多肽的生产中有一定的应用[26,27]。利用微生物发酵来制备多肽是利用微生物生长时分泌的酶对蛋白质原料进行降解的过程。因为在发酵过程中, 削减了令玉米肽发生苦味的因素, 这样就既避免了添加额外的脱苦设备, 也简化了生产工艺, 有效降低了生产的成本[13]。李军军等[28]利用米曲酶固态发酵制备玉米肽, 确定了米曲霉发酵玉米胚芽粕生产玉米多肽的最佳发酵条件: 玉米胚芽粕含量为 40% (60%麸皮), 培养基含水量为 74%, 培养基接种量为 7%, 培养温度为30℃, 发酵时间为84 h。在此条件下玉米肽转化率达到最大值36 %。应用微生物发酵制备玉米肽还处于起步阶段, 相信微生物发酵一定会以其独特的优势促进玉米肽制备的发展。

玉米蛋白粉酶解产物是多种肽的混合物, 对此混合物往往需要利用色谱分离技术如离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法、反向分配色谱法等常规柱色谱及高压液相色谱法、毛细管电色谱技术和电泳分离等手段来分析。对此多肽分子的分析, 主要包括等电点的测定, 氨基酸的组成、含量及序列的测定, 分子量分布, 结构的表征等。随着现代分析技术的发展, 多种技术手段应用到多肽分子的分析中, 如高效液相色谱法、质谱法、高效毛细管电泳法、核磁共振波谱技术(NMR)、傅里叶红外转换光谱及圆二色谱等。

质谱具有高选择性、高灵敏度以及能够提供分子量和结构信息的优点, 主要应用于多肽分子的一级结构的研究, 如氨基酸序列的测定。Samgina 等[29]应用电喷雾电离质谱(ESI–MS/MS)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI–MS/MS)技术对短肽分子的从头测序策略进行了研究。

相较单一的液相色谱或质谱技术, 高压液相色谱–质谱联用技术在多肽的分析中应用的更为广泛。高压液相色谱–质谱联用技术(high–pressure liquidchromatography–mass spectrometry, HPLC–MS)是以高压液相色谱为分离手段, 以质谱为鉴定工具的一种分离分析技术。它将高压液相色谱对复杂样品的高分离能力与质谱的优点结合起来[30]。Wang 等[31]利用快速HPLC/ESI–MS 等手段建立了一种分析来源于牛肾上腺髓质的一种生物多肽的方法, 多种多肽分子, 如Met–Enk、Leu–Enk、Leu–Enk–Lys 和Leu–Enk–Arg 等被鉴别出。Hernandez–Ledesma 等[32]利用反相高压液相色谱串联质谱(HPLC–MS/MS) 对发酵牛奶中的多肽分子进行了鉴别。Schweizer 等[33]利用反相高压液相色谱和质谱联用的技术来预测来源于油菜籽的低分子量多肽分子的氨基酸组成。Morifuji等[34]利用LC–MS/MS 手段分析了由3 种支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)组成的7 种二肽分子。Català–Clariana 等[35]利用液相–质谱联用技术鉴定了低过敏性婴儿奶粉水解液中的生物活性肽, 5 种多肽分子即LKP、IPY、ALPM、PGPIHN 和VAGTWY 被鉴定出来。Kunda 等[36]建立了微液相–飞行时间–质谱联用技术(micro LC–TOF–MS)检测酸奶中的小分子多肽, 通过保留时间预测的方法提高了鉴定的可靠性,最终从酸奶中鉴定出了50 种多肽分子。

早在1996 年, 高压液相色谱技术就应用于玉米肽的分析。Yamaguchi [5]等利用HPLC 技术研究了玉米蛋白粉水解物中多肽的分子量分布。随着液相色谱与质谱的发展, 液质联用技术也逐渐应用到玉米肽的分析中。Ma 等[37]利用HPLC–MS/MS 技术对玉米蛋白水解物中的多肽分子的初级结构进行了表征,利用了Fmoc 固相多肽合成技术合成了多肽分子Q–L–L–P–F, 得出这种多肽分子是玉米中促进乙醇代谢的主要成分之一。Puchalska 等[38]建立了一种利用高压液相色谱–质谱联用技术(HPLC–ESI–Q–TOF–MS)对不同品种玉米中蛋白酶解后3 种降压肽分子 (LRP、LSP 和LQP)含量的测定方法。

玉米肽表现出多种生物活性, 逐渐成为人们研究的热点。

高血压是一种严重影响人类生命健康的疾病,而血管紧张素转换酶是调节血压的一种重要的酶,许多化学合成药, 如卡托普利、依那普利等都是通过抑制此种酶的活性来达到降血压的目的; 但是它们的副作用也大, 因此人们将目光转向了来源于植物蛋白的血管紧张素抑制肽的研究, 而来源于玉米的多肽就有很好的血管紧张素转换酶抑制活性。

Suh 等[39]比较了6 种酶 (Protamax、Flavourzyme、Proleather、Protease A、Aroase AP–10、Pescalase) 水解玉米蛋白粉得到的玉米多肽的降压活性和苦味的大小, 得出风味酶水解物有最高的降压活性, 最终得出采用内切蛋白酶和外切蛋白酶的混合物水解玉米蛋白粉得到的玉米肽有较高的降压活性和较低的苦味, 并且成本较低。Yang 等[40]利用玉米蛋白粉酶解及凝胶和反向高压液相色谱等手段, 得到了活性多肽片段Ala–Tyr。此活性多肽分子有很好的血管紧张素转换酶抑制活性(IC50=14.2 μmol/L), 此降压活性通过动物实验得到了进一步的验证。Huang 等[41]比较了通过酶膜反应器制备的玉米肽的降压活性, 并且通过不同的超滤膜处理得到不同分子量分布的多肽分子混合物—玉米肽(Mw <1 kDa)、玉米肽(Mw <2kDa)、玉米肽(Mw <3 kDa)。玉米肽(Mw <3 kDa)具有最强的血管紧张素转换酶抑制活性(IC50=0.29mg/mL), 最终通过动物(自发性高血压大鼠)实验, 得出100 mg 玉米肽(Mw <3 kDa)与2 mg 的卡托普利具有相同的降压效果。Lin 等[42]利用玉米蛋白粉小规模生产玉米蛋白(90.68%), 利用两步酶水解玉米蛋白和多级分离手段制得低分子量的玉米寡肽(Mw <1 kDa),并对分离得到的二肽(Ala–Tyr)进行了定性和定量分析。二肽分子(IC50 =0.037 mg/mL)血管紧张素转换酶抑制活性是玉米寡肽(Mw <1 kDa)的27 倍多, 通过体内实验, 进一步验证了低分子量的玉米寡肽(Mw <1kDa)在原发性高血压大鼠内有很好的降压活性。

在当今社会人们对酒的消费越来越多, 而过度饮酒会对肝造成很大的损害, 这就促进了人们对于醒酒产品的研究。来源于植物蛋白的天然多肽分子以其无毒副作用的优势受到了人们的青睐, 而玉米肽醒酒产品的研究是当前的热点之一。

20 世纪90 年代, Yamaguchi 等[5, 6]研究了玉米肽在自发性高血压大鼠中的乙醇代谢活性, 得出在酒精注入之前使用玉米肽(1.0 g/kg)的大鼠, 血液中的乙醇浓度有快速的降低。长期摄入玉米肽对自发性高血压大鼠中乙醇代谢活性的研究表明, 长期摄入玉米肽可以通过增强乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)的活性, 促进机体的乙醇代谢, 同时减轻酒精带来的肝损伤[43]。玉米肽在健康人体中对乙醇代谢的影响说明玉米肽具有降低人体血液中酒精浓度的作用, 此种作用机制可能是通过提供潜在的NAD+,而不是延迟胃中乙醇的扩散, 也不是造成胃肠的吸收障碍[44]。之后, 对比分析了水溶性植物寡肽在自发性高血压大鼠中对乙醇代谢和血浆中氨基酸的影响,结果表明, 玉米肽降低血液中乙醇浓度, 这可能是通过显著提高血浆中丙氨酸和亮氨酸的浓度, 尤其是亮氨酸的浓度来实现的。Li 等[45]研究了玉米肽对酒精引起的极性肝损伤的保护作用, 以丙二醛(MDA)、甘油三酯(TAG)及谷胱甘肽(GSH)的浓度高低为评价肝损伤的指标, 以NH 小鼠为受试动物。结果显示,喂食玉米肽的小鼠肝脏中丙二醛和甘油三酯的浓度低于正常对照组, 而谷胱甘肽的浓度大于正常对照组, 因此玉米肽可以促进酒精的代谢, 对酒精引起的极性肝损伤有一定的缓解作用。Guo 等[46]研究了玉米肽对卡介苗(BCG)/脂多糖(LPS)诱发的小鼠免疫性肝损伤(ILI)的缓解作用, 通过对多个生化指标(AST、ALT、MDA、NO、SOD、GPX、GSH)和小鼠肝组织病理学参数的分析, 得出玉米肽对BCG/LPS 诱发的小鼠免疫性肝损伤有较强的缓解作用。当玉米肽的剂量为600 mg/kg bw 时, 与阳性对照水飞蓟素(50mg/kg bw)有相同的保肝效果。Ma 等[37]同样研究了玉米肽对酒精代谢的促进作用, 首先通过酶解制备得到玉米肽, 并对玉米肽混合物和固相肽合成(SPPS)的玉米多肽分子(Q–L–L–P–F)对乙醇代谢的影响作对比分析, 结果显示五肽分子(Q–L–L–P–F)对乙醇代谢的促进作用远大于玉米肽混合物。

研究表明, 玉米肽还具有抗氧化、抗疲劳、抗癌等多种生物活性。徐立等[47]制备具有类超氧化物歧化酶(SOD)活性的玉米功能短肽, 与SOD 进行活性比较; 结果显示, 含有2~6 个氨基酸残基的玉米功能短肽, 对邻苯三酚自氧化具有较好的抑制作用, 玉米功能短肽(C=10 mg/mL)的抑制率为21.78%, 并指出玉米功能短肽具有较好的类超氧化物歧化酶活性。Zhou 等[9]研究了玉米蛋白水解物的抗氧化活性, 指出低分子量的玉米蛋白水解物的抗氧化活性要高于高分子量玉米蛋白水解物的活性, 并且报道了玉米蛋白水解物能有效地抑制食品的脂质过氧化作用。昌友权[10]报道了玉米肽具有抗疲劳作用, 通过进行玉米肽对小鼠游泳时间、小鼠爬杆时间、血乳酸、血中尿素氮、肝糖原含量和肌糖原含量等的影响实验, 得出玉米肽能增强小鼠游泳耐力, 延长爬杆时间, 降低血乳酸、血中尿素氮的含量, 提高肝糖原含量和肌糖原含量。Yamaguchi[6]等报道了玉米肽在雌性大鼠中对二甲基苯丙蒽(DMBA)诱导的乳腺肿瘤生长的抑制作用。Li 等[48]研究了玉米肽的抗肿瘤机制, 通过体外的实验指出玉米肽能够诱导人肝癌细胞HepG2 的凋亡, 体内实验证实了玉米肽能够抑制肿瘤的生长,增强脾脏功能, 增加细胞因子IL–2、IFN–γ和TNF–α的浓度, 能够延长患有H22 肿瘤的小鼠存活时间, 并指出玉米肽能够通过增强机体免疫系统的功能来抑制肝癌细胞的增生。

玉米肽已成为人们研究的热点, 但其实际的应用特别是国内的应用还比较少。现主要体现在食品领域, 它可作为一种功能食品推向市场。国外对于玉米肽的食品开发技术比较成熟, 早在20 世纪90 年代,日本已经利用玉米肽开发出了一种低热量早餐饮料,这种饮料利用了玉米肽的低粘度、高溶解性等特点,是一种具有酸奶酪风味的饮料[49]。当前, 日本食品化工开发公司以玉米蛋白粉为原料生产的玉米肽饮料已经上市。韩国制药公司应用玉米肽开发的醒酒饮料也已开始进入国际市场[13]。

玉米肽的制备方面主要采用酶解的方法, 且多采用单一酶得到水解产物, 对于复合酶及酶固定化的技术应用较少。除此之外, 采用微生物发酵来直接制备玉米肽的研究也较少。微生物发酵可以减少玉米肽制备过程中的苦味, 简化工艺流程, 降低成本, 这将会成为玉米肽制备产业化发展的重要趋势。

通过以上方法得到的玉米肽表现出多种生物活性, 尤其是醒酒活性及降压活性; 玉米肽在抗癌及抗氧化等方面也有巨大的潜力。但是对于活性的研究主要集中在玉米肽多种分子混合物上, 对于单一的多肽分子的活性报道较少。玉米肽分子的结构表征可以为解释玉米肽的生物活性奠定结构基础, 而现代分析技术是对玉米肽分子进行结构表征必不可少的有效手段,高压液相色谱及质谱技术在多肽分子的分析研究中有了一定的应用, 其他技术手段如高压毛细管电泳技术、核磁共振技术、傅里叶红外转换光谱及圆二色谱技术在玉米肽分子的分析研究中还未见报道, 综合应用多种现代技术手段将会为玉米肽分子的结构研究提供强有力的保障。

随着研究的深入, 玉米肽的应用也会越来越广, 不仅体现在食品领域, 在医药研究领域也会有很大的发展空间, 多肽和蛋白质类药物是目前医药研发领域中非常活跃、发展非常迅速的一部分, 对玉米肽进行结构修饰以及构效关系的研究, 以提高药效、降低副作用, 将会成为新药研发的重要渠道。玉米肽在制备方面原料易得、成本低, 且具备非常重要的生物活性, 玉米肽的研究可以带动玉米蛋白粉的利用, 实现资源的高值化, 预期将会有一个非常广阔的开发前景。相信随着研究的不断深入及生物技术和其他技术的不断发展, 玉米肽将会给人们带来更多的社会效益和经济效益。

参考文献（参考文献多，篇幅过大，此处略过）