487期-4:【技术】基于384微孔板单蛋白组合分析



1971年瑞典学者Engvail和Perlmann，荷兰学者Van Weerman和Schuurs第一次报道了将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫分析（ELISA, Enzyme-linked immunosorbent assays）。该技术作为主要的分析检测技术已经发展和应用了超过40年。Voller和Bidwell首先应用96孔微孔板用于ELISA，目前90%的ELISA分析都是基于96孔微孔板平台进行的。

随着ELISA分析的发展，该技术已经成为在传染性疾病的诊断和筛查中最为常用的一种方法，为了提高ELISA的分析性能，在基于96孔微孔板平台的分析中，不得不在每个孔中包被多个蛋白。每孔中包被多个用于捕获的抗原或者抗体，能够减少试剂漏检的几率，但随之而来的是不同包被抗原或抗体间的相互干扰，为了消除和平衡这种干扰，不得不丧失单个抗体或抗原包被能够获得的最大灵敏度；而与之对应的酶偶联物也需要是多蛋白混合的组分，在优化这种混合的酶偶联物时，为了控制背景值，不得不损失一定程度的分析灵敏度。

多蛋白的混合包被在一定程度上丧失了单蛋白包被的分析灵敏度，并且逐渐被人们认识到，那为什么目前还没有其他平台代替呢？基于96孔微孔板的ELISA分析，当需要检测多于1个目标检测物时，将导至标本量、试剂量、总工作量和时间增加，并且成本随之增倍。为此，我们基于384孔微孔板的平台设计了单蛋白组合分析系统，并将反应体系由96孔微孔板平台的100μl减少到30μl，并将原来在96孔微孔板的一孔中包被的多个蛋白分别拆分到384孔微孔板中的4个孔中分别包被，每个孔中只包被单一的蛋白（如图1）。

图1 四种颜色分别代表四种不同的蛋白

从96孔微孔板平台的100μl反应体系变为384孔微孔板的30μl反应体系，会不会影响ELISA分析的检测性能呢？我们分析比较了关键的影响参数：总的工作表面积、总的工作表面积与工作体积比和反应体系形成的光径即液体高度。比较结果详见表1。

比较显示，1）检测分辨率即信号获得量（由光径决定）基于384孔微孔板的30μl反应体系同基于96孔微孔板的100μ反应体系是相同的。2）总的工作表面积，基于384孔微孔板的4孔是基于96孔微孔板的1孔的2倍。

基于384孔微孔板的单蛋白组合分析如何提高检测分析的特异性和灵敏度呢？1）单蛋白-单蛋白结合具有最大亲和力而稳定的复合物，并不存在交叉干扰：在这个系统中，每孔中只包被一种蛋白（抗原或抗体），没有多蛋白混合包被中不同包被蛋白和酶结合物中不同酶标蛋白间的干扰，保证了选择捕获的抗原或抗体和酶标的抗原或抗体都是结合滴度最大的，同时也保证了选择的抗原或抗体是专一性最强的。2）区别于普通样本稀释液的u-SD统一的样本稀释液：除了具有普通样本稀释液的去除人类风湿因子等干扰因素的功能外，u-SD还含裂解活性剂，将分析物在标本中以抗原-抗体复合物(Immune Complex)解体，以增强早期灵敏度。3）高标准的原材料选择：建立于世界级IVD产品基础上，选择新一代的抗原或抗体生物原材料；基于高蛋白结合能力的384孔微孔板和Biotin-SA蛋白结合信号放大系统。

基于384孔微孔板的单蛋白组合分析系统通过4孔组合分析提高了目标标志物检出的几率，同时单蛋白包被最大限度的提高了分析灵敏度和特异性。该技术平台的发展，进一步发展了ELISA的分析技术，在未来的发展中将会使ELISA分析技术提高到新的超灵敏度水平。

参考文献：

1. Drug Discovery World Fall，2012：ELISAAssays recent innovations take analyte

detection to new levels.

2. Analytical Biochemistry，397 (2010) 48–52：A simpleapproach to improve the sensitivity of enzyme-linked immunosorbent assay: Usingthe IMAPlate 5RC96 for result readout.

3. J. Immunol. Methods，125 (1989) 279–285：a novelmethod of signal amplification: application to immunoassays.

4. Anal. Biochem., 382 (2008) 35–39: Establishmentof a miniaturized enzyme-linked immunosorbent assay for human transferrinquantification using an intelligent multifunctional analytical plate.

来源: 澳斯邦 作者：业务研发中心 陈正斌

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