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不同土壤DNA提取和纯化试剂盒及方法的比较

生物论荐 2019-06-11 13:53:37

【摘要】 环境样品DNA的提取和纯化不仅是土壤微生物进行研究的前提条件,而且是环境宏基因组学中最关键的技术问题之一,DNA的产量和纯度对后续的一系列的分子生物学技术操作如:多聚酶链反应(PCR)扩增、核酸内切酶酶切消化、核酸分子杂交等等,都会产生很大的影响,所以后续试验有效进行,必须要先获得一定纯度、数量、有较好代表性和适当片段长度的DNA。本文针对三种典型的土壤类型(壤土、粘土和沙土),对目前应用比较广泛的三种不同的DNA提取方法和四种不同的DNA 纯化方法的效果进行了比较。经过NanoDrop分光光度计和琼脂糖凝胶电泳对从三种典型土壤中提取和纯化的DNA的浓度和纯度进行检测,结果表明:Power Soil® DNA提取试剂盒和苯酚 - 氯仿抽提,异丙醇沉淀纯化方法的结合能提供满足环境组学研究的宏基因组测序要求的DNA。

【结论】

1 DNA提取方法的比较结果 

经NanoDrop检测后,三种DNA提取方法所提取的DNA的浓度见表1。结果表明Meta-G-NomeDNA提取试剂盒从土壤中提取出的DNA量少,低于浓度检测下线。原位裂解法与PowerSoil®DNA提取试剂盒都能提取出DNA,并且PowerSoil®DNA提取试剂盒提取的DNA浓度是原位裂解法提取的2.2倍,这说明PowerSoil®DNA提取试剂盒与原位裂解法和Meta-G-Nome DNA提取试剂盒相比能够提取出更多的DNA,有更高的DNA产量,所以用该试剂盒提取DNA的方法要优于其他两种方法。 

表1 用不同方法提取的DNA 的产量和经NanoDrop分光光度计测定的DNA 的浓度。

 

 

2 DNA纯化方法的比较结果     

用不同的纯化方法处理后的土壤DNA的A260/A280及A260/A230值见表3。较纯的DNA的A260/A280及A260/A230值均在1.75~2.1之间,若有蛋白质类物质污染则A260/A280值偏低,若有腐殖酸类物质污染则A260/A230值偏低。为了满足后续宏基因组测序的需要,纯化后DNA的浓度 > 20 ng/µL为宜。

从表3可以看出,在这三种纯化方法中,方法2纯化后的DNA的浓度最高,为14.8ng/µL,方法1的DNA的浓度最低,为11.8ng/µL。但是,它们的浓度均未超过20 ng/µL,所以在DNA浓度的角度上这三种纯化方法不符合后续试验的要求。另外,纯化前的土壤DNA的A260/A280及A260/A230值均较低,粗提的土壤DNA经方法1纯化后,土壤DNA的A260/A280值有所提高,但是A260/A230的值却降低了,说明在用该种方法纯化的过程中DNA被腐殖酸类物质污染了。而经过方法2,3纯化后虽然A260/A280和A260/A230值都有所升高,但是方法3的土壤DNA的A260/A280值不在1.75~2.10之间,说明用方法3纯化后,仍存在DNA被蛋白质污染的现象,虽然方法2获得的DNA的纯度最高,但是它和方法3一样,纯化的DNA的A260/A230值也都低于1.75,表明这两种纯化方法纯化的DNA都存在腐殖酸类物质的污染。  因此,DNA纯度检测结果表明这三种纯化方法,凝胶净化和QIAEX II凝胶提取试剂盒,PowerClean DNA清洁试剂盒和Agencourt公司AMPure XP的PCR纯化系统(其中经PowerClean DNA清洁试剂盒纯化获得的DNA纯度最高,DNA的浓度也最高。)无论是在DNA浓度方面还是在DNA纯度方面,其均未能获得宏基因组测序所需要的相应的纯度和数量DNA(表2)。所以,我们主要看一下第4种纯化方法—苯酚/氯仿抽提和异丙醇沉淀法。(表3和图1)

表2 用不同的清理方法获得的DNA的纯度和产量


表3 是PowerSoil®DNA提取试剂盒和苯酚 - 氯仿抽提,异丙醇沉淀纯化方法的结合在高浓度和高纯度的不同土壤样品中所提供的DNA浓度和纯度。针对三种不同的土壤类型,壤土,粘土和沙土使用该方法纯化所得到的DNA的浓度均高于以上三种方法,虽然就A260/A280来讲,其值要低于用方法2纯化所得到的值,但是,总体来讲用该种方法所得到的DNA的A260/A280和A260/A230的值均在1.75~2.10之间,表明用这种方法提取的DNA较纯,既没有受到蛋白质的污染,也没有受到腐殖酸类物质的污染,由此可以看出,使用该方法来纯化土壤DNA要优于用以上提到的三种纯化方法,并且满足后续试验的需要。

表3 从三种不同的土壤中用PowerSoil®DNA 分离试剂盒纯化和用酚 - 氯仿抽提,异丙醇沉淀提取的DNA 的产率和质量


图1是用PowerSoil®DNA分离试剂盒提取,并用苯酚 - 氯仿提取和异丙醇沉淀纯化结合的方法所获得的的DNA的琼脂糖凝胶电泳图像,从图2中可以看出这种结合的方法从三种不同类型的土壤中均能提取出DNA,说明在提取DNA的过程中不存在DNA降解的现象。这种方法针所获得的DNA凝胶电泳图像,条带明亮并且清晰单一,可适用于后续的宏基因组测序分析。


图1 用PowerSoil®DNA分离试剂盒提取,并用苯酚 - 氯仿提取和异丙醇沉淀纯化结合的方法 所获得的的DNA的凝胶电泳图像

【结论】

对于土壤微生物总DNA提取和纯化方法的评价,根据不同的目标有不同的指标(本文主要从DNA的浓度和纯度的指标上进行比较)。从土壤中提取微生物总DNA,不仅要保证DNA的片段足够大,数量多,杂质少,而且过程的简单、省时、所用成本的高低也是不可忽视的。

经比较发现,在本文论述的三种DNA提取方法中,PowerSoil®DNA提取试剂盒与其他两种方法相比提取的DNA的浓度更高,并且Power Soil® DNA提取试剂盒和苯酚 - 氯仿抽提,异丙醇沉淀纯化结合的方法从土壤中获得的DNA的纯度更纯(260/280的值和260/230的值均大于1.8),浓度更高(纯化后浓度 > 20 ng/µL),从而为环境组学研究的宏基因组测序提供了合适的DNA。而这种方法对本文提到的三种典型的土壤样品的DNA的提取和随后的纯化也表明其比在文中描述的其它方法要好的多。

但是就成本而言,在3种提取方法中试剂盒的成本要高于原位裂解法,而就时间来说,苯酚/氯仿抽提和异丙醇沉淀的方法所用的时间要长于用试剂盒纯化,所以这也是这种方法的相比于本文提到的其它方法的缺陷所在。而且本文只选取了三种土壤类型,其pH呈酸性和中性,而对pH呈碱性的土壤却未涉及,这也是本研究存在的问题。


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