1 株广谱抗菌活性菌株的筛选鉴定及其抗菌蛋白的分离纯化

枯草芽孢杆菌是一种内生孢子的革兰氏阳性菌，具有较强的抗逆能力，也是目前环境中广泛存在的非致病性细菌，不产毒素，对人畜不产生危害，具有良好的发酵能力，在农业和食品领域已被广泛应用。此外，枯草芽孢杆菌还能够产生多种抗菌蛋白，对常见的病原性细菌和真菌具有较好的抑制作用，尤其是在生物防治植物病虫害方面有着重要应用。然而还有许多枯草芽孢杆菌产的抗菌蛋白未被开发，筛选能够产生高效广谱抗菌蛋白并可应用于食品工业的微生物菌株，将为天然抗菌蛋白的应用开辟更广阔的前景。

来自河南科技学院食品学院的赵圣明、赵岩岩和马汉军等人从中国传统发酵腊肉中分离获得1 株对食源性致病菌具有较强抑制活性的枯草芽孢杆菌菌株，采用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析对抗菌蛋白进行分离纯化，并对其抑菌活性进行测定，为抗菌蛋白在食品防腐保鲜中的开发应用提供参考依据。

 抗菌活性菌株的分离筛选结果

以湖南传统农家自制腊肉为筛选样品，通过琼脂块法进行初筛，共筛选获得79 株对蜡样芽孢杆菌和荧光假单胞菌具有较好抑制活性的菌株。通过琼脂扩散法进行抑菌活性的复筛，确定19 株菌具有较好的抑菌效果，对指示菌的抑菌效果见表1。其中菌株HLR13的抑菌效果最好，对5 株指示菌（蜡样芽孢杆菌、荧光假单胞菌、大肠杆菌、藤黄微球菌和肠炎沙门菌）均具有较好的抑制作用，对蜡样芽孢杆菌的抑菌圈直径达到了19 mm。因此本研究选取菌株HLR13为后续实验菌株。

菌株生理生化和分子生物学鉴定结果

经革兰氏染色和镜检观察菌株形态确定该菌株为革兰氏阳性，菌体呈直杆状，两端钝圆，可形成卵圆形芽孢，芽孢孢囊膨大，中生至次端生。菌落在LB琼脂培养基上生长菌落大小直径约为0.3～0.5 mm，不产色素，菌落呈淡黄色，近圆形，表面光滑，无明显褶皱，边缘整齐，黏稠，微凸起，有光泽。菌株生理生化结果显示，硝酸盐实验、柠檬酸盐实验、V-P实验、接触酶实验和淀粉水解实验等呈阳性，甲基红实验、吲哚实验、H₂S实验和尿素实验呈阴性。结合以上菌落培养特征和生理生化特征，初步将菌株HLR13鉴定为枯草芽孢杆菌。

结合形态学特征、生理生化实验以及16S rDNA系统发育树结果最终确定菌株HLR13在细菌分类学上属于枯草芽孢杆菌斯皮兹仁亚种（B. subtilis subsp. spizienii）。

抗菌蛋白的分离纯化

浓缩后的抗菌蛋白粗提液经QFF离子交换层析，得到2 个未被吸附的蛋白组分和4 个被吸附的蛋白洗脱组分（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），抑菌活性检测后发现，0.1 mol/L NaCl洗脱液洗脱下的组分Ⅰ具有抑菌活性，其余组分均无抑菌活性，说明采用该离子交换层析可以有效地将其他杂质和抗菌蛋白分开。合并收集抑菌活性组分Ⅰ，浓缩后采用Sephadex G-75凝胶层析进一步纯化。经洗脱后得到2 个蛋白洗脱组分S1和S2。经抑菌活性检测，发现S2蛋白洗脱峰具有抑菌活性，将S2抑菌活性组分浓缩后4 ℃保存用于下一步分析。

 分子质量测定结果

经凝胶层析纯化后，抗菌蛋白电泳显示为单一条带，表明抗菌蛋白的纯化达到电泳纯，根据标准分子质量蛋白可得到该抗菌蛋白的表观分子质量约为29.8 kDa。

MALDI-TOF-MS/MS分析结果

将其中信号较强的4 个分子质量为1030、1191、1589 Da和1685 Da的解离肽段进行二级质谱分析。将质谱测得的蛋白肽指纹图谱及解离肽段的二级质谱数据通过Mascot软件在线检索NCBI数据库得知，蛋白得分最高者为188 分，是一种枯草芽孢杆菌产的假定蛋白。经Mascot软件检索NCBI数据库细菌全库，通过计算得分超过78 分以上，检索结果具有显著性（P＜0.05），且分数越高，说明蛋白的相似性及比对结果的可信度也更高。因此，根据比对结果可以初步确定该抗菌蛋白为枯草芽孢杆菌假定蛋白，可能为一种新抗菌蛋白，测得该蛋白的分子质量为31494 Da，与纯化的蛋白条带在分子质量上较为相近。

抗菌蛋白的抑菌活性

经Sephadex G-75凝胶层析纯化得到的抗菌蛋白对食品中常见的一些致病菌和腐败菌具有显著的抑制作用，包括蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌、肠炎沙门菌、生孢梭菌、藤黄微球菌、串珠镰刀菌和黄曲霉。

结  论

采用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析（Q Sepharose FF）和凝胶过滤层析（Sephadex G-75）等方法对该菌株所产抗菌蛋白进行分离纯化，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测显示纯化后的蛋白为单一条带，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析和NCBI/nr蛋白数据库比对初步确定该抗菌蛋白分子质量为31 494 Da，是枯草芽孢杆菌产生的一种假定蛋白。本实验可为新型天然防腐剂的开发提供一定理论依据。

本文《1 株广谱抗菌活性菌株的筛选鉴定及其抗菌蛋白的分离纯化》来源于《食品科学》2018年39卷2期170-176 页，作者：赵圣明，赵岩岩，马汉军，何鸿举。DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802027。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：李莹；责编：张睿梅

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