蛋白质组学系列三:蛋白酶解与色谱分离

2023-05-10 14:56:27

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继推出蛋白质组系列:样本采集与预处理、蛋白提取及质控,本期终于迎来样本制备的最后一关。

DuangDuangDuang!蛋白酶解开讲啦!同时奉上色谱分离方法,绝对让您不虚此行,满载而归!

先来总结一下整个蛋白质组学的流程,看图更清晰



喏,蓝线以上都是属于样本制备阶段。下面我们开始细述蛋白酶解过程。


蛋白酶解

蛋白酶解就是指蛋白质在蛋白酶的作用下分解成肽段的过程。由于质谱检测的是肽段,再由肽段序列推导出蛋白序列,因此蛋白酶解是样本制备阶段非常重要且必需的环节。


蛋白酶的选择


蛋白酶的种类很多,如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、羧肽酶等。其中,胰蛋白酶(Trypsin)是特异性最强的蛋白酶,能够对蛋白质的赖氨酸和精氨酸残基的羧基端进行酶解,在蛋白质组学研究中,这种严格的特异性使其被广泛用于蛋白质的酶解和鉴定。此外,也可以结合其它酶(比如Lys-C)进行多酶酶切,使肽段变得短一些,以提高蛋白的鉴定率。


蛋白酶解及脱盐步骤



知识拓展

  • 酶解需要在buffer体系下完成,比如25mM碳酸氢铵体系(pH 7-8)或者TEAB( 三乙基二乙胺盐,10-100mM)。如果要做TMT/iTRAQ标记,最好用TEAB;因为TMT/iTRAQ试剂是标记末端氨基,碳酸氢铵上的氨基也会被标记上,影响蛋白的标记效率。

  • 蛋白酶的用量一般按照W(酶):W(底物)=1:20 - 1:50 ;若蛋白分子量大,可适当提高酶与底物的比例。

  • 酶解是否充分的质控标准:在胶图中不可见蛋白条带,即认为酶解充分。

  • 脱盐的原理:多肽在酸性环境下会吸附在C18柱子上,而盐不溶于有机试剂,纯化过程就是不断地去除盐分,余下的成分即除盐纯化后的多肽,最后用有机试剂将其洗脱下来。

  • 做体外标记定量的童鞋们请注意!标记过程即是在酶解脱盐之后进行。纯化后的肽段进行标记混合,产生mix样本,然后使用SCX脱盐纯化。脱盐之后的混合样本可冻干保存,或直接进行后续实验。


Okay,样本制备完成!下面进入分析仪器的世界~


液相色谱分离

液相色谱分离技术是基于不同组分在由固定相和流动相构成的体系中呈现不同的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子大小,从而实现对复杂混合物的分离,便于质谱上机分析。


液相色谱法分类


按照分离机制的不同可分为:液固吸附色谱法、液液分配色谱法、离子交换色谱法、分子排阻色谱法。

目前,在蛋白质组学研究中,反相分配色谱法应用最广泛,根据肽段疏水性不同来实现分离。


液相色谱系统组成

液相色谱系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置组成,有些仪器还有梯度洗脱装置、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等。


下图是RIGOL的液相色谱仪,左边是数据记录及处理装置,右边从上至下分别是输液泵、进样器、色谱柱、检测器。


我们进行蛋白质组学研究时,与质谱联用的液相色谱仪是纳升液相色谱,其与普通的液相色谱的主要区别是在色谱柱粗细和流速上。与常规液相色谱柱相比,纳升液相色谱的柱子直径缩小了20-100倍,相应地,流动相的流速下降了1000倍左右,因此极大降低了样品被流动相稀释的倍数,从而提高检测的灵敏度。是不是很机智!


色谱分离的目的

蛋白质的鉴定主要是基于质谱仪产生的谱图。蛋白酶解后产生大量的肽段,甚至高达几十万种,质谱很难同时检测到这么多种肽段。所以对肽段混合物进行分级,可以降低检测的难度,得到更多的蛋白鉴定结果。


色谱分离的策略


我们在做分离时,通常收集的馏分越多,能鉴定到的蛋白也就越多。但分离馏分数目达到一定程度时,能鉴定到的蛋白数量增长也会饱和。


这里还有学问哦,分离出的馏分再行合并会使肽段分布更加均匀,蛋白鉴定结果更好。那如何合并?紧邻的馏分合并吗?NoNoNo!这样并没有意义的,叉开合并才是正解,看图你就明白啦!下图展示了由40个馏分再合并成20个、12个、5个馏分的方法示意图。


最后,小编提醒大家,液相色谱仪要做好维护和保养,毕竟仪器性能稳定才会有良好结果产出。


液相色谱就讲到这里了,但是肽段数量千千万,单有色谱恐难辨其真身,只有液质联用方可尽显神奇,所以下期小编会继续为大家隆重介绍色谱的完美搭档——质谱,敬请期待~


小贴士

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